1-甲基环丙烯通过抑制扩展青霉的生长来抑制采后苹果青霉菌

关键词

采后病害

扩展青霉

1-甲基环丙烯

苹果

摘要

本文研究了1-甲基环丙烯(1-MCP)对扩展青霉（P.expansum）导致的苹果青霉病害以及P.expansum在体外生长的抑制作用。5mu;L L^-11-MCP处理可显著降低P.expansum导致的苹果果实的病害程度，抑制P.expansum的菌丝生长和孢子萌发。1-MCP处理后，P.expansum的孢子质膜完整性降低，孢子中的活性氧合物和菌丝中的丙二醛剧增，表明1-MCP处理可增强P.expansum氧化损伤以及破坏孢子质膜的完整性。这项研究首次表明，1-MCP通过抑制P.expansum生长来抑制采后苹果青霉病害。

1、 引言

真菌病害引起的采后变质是影响世界水果质量和市场价值的主要问题，控制真菌病害是通过广泛喷洒杀菌剂来实现的。由于对环境和人类健康的日益关注，人们越来越需要寻求其他方法来控制疾病。最近，许多策略，包括使用拮抗酵母菌的生物控制、外源植物调节物质的应用、生物活性物质和化学复合物的应用，这些方法已成为果实采后病害防治的有效策略。

根据成熟特性，将果实命名为跃变型和非跃变型。跃变型果实的特征是在成熟期出现呼吸爆发，乙烯产量大幅度上升。待成熟之后再采收的果实是柔软、香甜的，成熟前采摘的果实则保持品质，延长贮藏寿命，暴露于外源乙烯可以启动其成熟和衰老。1-MCP是一种环烯烃，它能和乙烯受体结合，抑制乙烯的作用，阻止衰老和成熟相关基因的激活。1-MCP对几种跃变型果实成熟衰老的调控具有很大的作用，并保持其质量和延长保质期，如苹果、香蕉、橘子、草莓、杏、芒果、木瓜、番茄、红枣和榴莲。此外，它还具有抑制或减轻水果表面损伤、果皮褐变和果实内部褐变的重要作用。到目前为止，对1-MCP的研究大多数集中在其对成熟果实采后衰老的控制作用。没有研究表明它在控制真菌病原体方面的功能。

P.expansum引起的采后青霉病是苹果果实中的主要病害之一，其传播速度快，往往带来了巨大的全球经济损失。在本研究中，首次确定了1-MCP对P.expansum体外对苹果采后青霉生长的影响。

2、 材料与方法

2.1 植物材料

苹果[Malus domestica Borkh.cv.Red Fuji]在天津农产品采后生理及贮藏重点实验室试验果园收获。对没有物理伤害或感染的水果进行分类挑选。选用2%（V/V）次氯酸钠表面消毒2min，再用自来水洗净，晾干后再使用。

2.2 病原菌

P.expansum从腐烂的苹果上分离、在25℃马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上培养14天。通过向培养基中加入含0.05%（V/V）的Tween-80的无菌蒸馏水，获得了孢子，再用血球计数板将孢子悬浮液浓度调整为1times;10⁴ ml^-1。

2.3 1-MCP

1.579g的1-MCP（0.14%，SmartFreshTM Technology）溶解在10ml蒸馏水中，储存于5℃，并立即应用于下列实验。

2.4 抑菌实验

用无菌针在苹果上打出一个深3mm，宽3mm的伤口，接种1times;10⁴ ml^-1P.expansum分生孢子悬浮液。接种后的水果放进密封的保鲜仓中（容积：9.072L），每升孢子悬浮液分别加入1、3、5mu;L的1-MCP（分别为90.72，272.16，453.6mu;L）。以90.72、272.16、453.6ml蒸馏水为对照，将新鲜水果放入密封保鲜仓（V：9.072 L）。所有果实贮藏于20°C，观察发病率和病斑直径。每个处理做三次重复，共15个水果，整个实验重复两次。

图1. 5mu;L L^-1 1-MCP对P.expansum引起的苹果果实青霉病的影响，竖线表示均值的标准偏差，星号表示P值的统计学差异Ple;0.05 (*) 或者 Ple; 0.01 (**)

2.5 1-MCP对体外P.expansum的影响

取P.expansum孢子悬浮液3mu;L（1times;10⁴mL^-1孢子）转移到PDA培养皿（直径：90mm，体积：60mL）中。然后，取0.6，1.8和3mu;L的1-MCP溶解到PDA空白板（分别在培养皿中加1, 3和5mu;L L^-11-MCP），将培养皿立即密封，培养在25℃下。P.expansum分别和0.6、1.8、3ml蒸馏水点在空白PDA上对照。观察1-MCP对P.expansum对菌丝生长的影响。100mu;LP.expansum的孢子悬浮液（1times;10⁴ mL^-1孢子）添加到50mlPDB（体积：150ml）中。然后，将1.5，4.5和7.5ml的1-MCP溶液转移在150ml玻璃管中并立即密封（分别为1、3、5ml的1-MCP在玻璃管中）。分别将1.5、4.5和7.5ml蒸馏水装入玻璃管中，与P.expansum孢子悬浮液作对照。所有处理过的玻璃管置于旋转摇床中，200rpm，25℃，经过12和18h的培养，测定了约300个孢子的发芽率。当芽管长度等于或大于孢子长度时，则孢子是萌发的。每个处理重复三次，实验重复两次。

图2. 5mu;L L^-11-MCP对体外P.expansum菌丝生长和孢子萌发的影响，竖线表示均值的标准偏差，星号表示在P值的统计学差异Ple;0.05 (*) 或者 Ple; 0.01 (**)

2.6 质膜的完整性检测

1, 3和5ml1-MCP处理 6和12 h后，孢子从玻璃管取出，用碘化丙啶染色。孢子染色观察并拍照axioskop 40使用显微镜（Carl Zeiss, Oberkochen, Germany）设有独立的荧光素罗丹明滤波器组（Zeiss no. 15: excitation BP 546/12 nm, emission LP 590 nm）成像axiocammrc数码相机（Carl Zeiss, Oberkochen, Germany）。每个样本随机选取三个视野，将亮场孢子数定义为总个数。用下面公式计算膜的完整性：MI＝[1-(the number of spores in fluorescent field/the number of spores in bright field)] times;100%。每次治疗重复三次。

2.7 丙二醛含量测定

将P.expansum孢子悬浮液转移到含有0.1LPDB和菌丝的三角瓶中，在200rpm，25℃的条件下培养3天。2g菌丝体和0.1L的PDB转移到500ml的三角瓶中，然后分别加入5ml、15ml和25ml的1-MCP溶液在三角瓶中，培养在200rpm，25℃条件下。在培养0、6、12h后，收集菌丝体，测定其MDA含量。2g菌丝体和0.1LPDB放入三角瓶中，分别加入5、15和25ml蒸馏水作为对照组。各处理中有三个重复，实验进行两次。

2.8 统计分析

所有数据均采用单因素方差分析（ANOVA），平均分离采用Duncanrsquo;s multiple range试验。

3、 结果

3.1 1-MCP对青霉病的发病率和病害程度的影响

在本研究中，5ml的1-MCP就显著控制苹果果实的腐烂率和P.expansum引起的病斑扩展。处理48 h后，对照果实完全腐烂，但1-MCP处理的果实腐烂率为66.7%。此外，P.expansum接种24, 48和72 h后，5ml的1-MCP处理的果实病斑直径分别为为0、8.4和14.2mm，而对照组分别为3.6、13.5和18.8mm。发现1或3ml的1-MCP处理的果实与对照果实之间无显著性差异。

3.2 1-MCP在体外对P.expansum菌丝生长和孢子萌发的作用

5ml的1-MCP在体外对P.expansum菌丝生长有显著下降的作用。48和96h过后，1-MCP处理过的P.expansum菌落直径分别为4.33和4.53mm，而对照组分别为6.12和13.33mm。P.expansum在控制下，菌丝颜色在开始培养48 h后变成绿色，96h后完全变绿。然而，用5ml1-MCP处理，在96h后菌丝的颜色没有变成绿色，直到120h后，才开始变绿。1和3ml的1-MCP在控制条件下处理菌丝体无显著变化。

培养12 h和18 h后，用5ml的1-MCP处理P.expansum的孢子萌发率分别只有0和2.33%，而对照组分别为2.5和29.67%。用1或3ml的1-MCP处理孢子没有明显的变化。

图3. 5mu;L L^-11-MCP对体外P.expansum孢子萌发的影响，竖线表示均值的标准偏差，星号表示在P值的统计学差异Ple;0.05 (*) 或者 Ple; 0.01 (**)

3.3 1-MCP对P.expansum孢子质膜完整性的影响

为了定量测定在1-MCP下P.expansum菌活力，1-MCP处理的孢子染色皮。有完整质膜的活孢子将排除孢子外面的化学物质。否则，不健康的孢子会在孢子内积累荧光值。培养6 h和12 h后，孢子在控制下MI分别为98和96%，然而，5ml的1-MCP处理孢子分别只有93和85%。发现1或3ml1-MCP处理后的孢子和对照组之间MI没有明显的变化。

3.4 测定活性氧化合物的含量

1-MCP在25℃下处理P.expansum6, 12和18h，对活性氧进行监测。培养6, 12，18 h后，大约有56, 78和91%个孢子在控制下，在5ml1-MCP处理下大约有31, 35和52%的孢子被DCHFDA染色。发现1或3ml1-MCP处理，P.expansum孢子没有明显的变化。

3.5 丙二醛含量的变化

通过测定丙二醛含量测定由1-MCP造成的P.expansum脂质损伤。与对照组相比，观察到 5ml1-MCP处理6、12 h后的P.expansum菌丝体的中高水平的丙二醛。发现1或3ml1-MCP处理后的孢子和对照组之间丙二醛含量没有明显的变化。

4、 讨论

苹果是对乙烯有反应的跃变型果实,在成熟和衰老过程中呼吸作用和乙烯产生显著增加。据以往的研究报道，1-MCP有预防或延缓采后苹果果实衰老的作用。在本研究结果中，与对照相比，由P.expansum导致的采后苹果青霉病的发病率和严重程度经1-MCP处理显著降低，表明1-MCP对采后苹果果实中由P.expansum引起的青霉病起到抑制作用。

图4. 5mu;L L^-11-MCP对P.expansum孢子质膜完整性的影响，竖线表示均值的标准偏差，星号表示在P值的统计学差异Ple;0.05 (*) 或者 Ple; 0.01 (**)，

乙烯在调节植物生理过程中起重要作用，包括种子萌发、植物生长、果实成熟、器官衰老和脱落，和病原体抗性。外源乙烯处理也能促进青霉孢子的萌发以及增加柑橘果实的腐烂，并且使草莓果实中由灰葡萄孢菌引发的灰霉病症状变得更严重。1-MCP已被证实可以结合乙烯受体预防乙烯依赖性反应，通过抑制乙烯生物合成基因的表达来阻止乙烯的产生以及延缓果实中乙烯受体的mRNA的转录。利用微阵列杂交使转录组特征化，发现参与乙烯生物合成的ACO和ETR基因和信使基因是可利用1-MCP促进和抑制苹果成熟的基因。在目前的结果中，1-MCP作为有效的乙烯拮抗剂确实可以抑制乙烯在果实中的生成，并且通过影响P.expansum的生长，减少苹果果实中青霉病的产生。这些结果与Su and Gubler 的研究成果（1-MCP对降低番茄果实采后腐烂的作用）相似。这可能是1-MCP抑制采后苹果青霉病的机制之一。

图5. 1-MCP对P.expansum孢子活性氧合物产生的影响，竖线表示均值的标准偏差，星号表示在P值的统计学差异Ple; 0.01 (**)

图6. 5mu;L L^-11-MCP对P.expansum丙二醛含量的影响，竖线表示均值的标准偏差，星号表示在P值的统计学差异Ple;0.05 (

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