响应面法优化抗氧化多酚类化合物提取黄西番莲种子（西番莲Sims）

原文作者：Fernanda Carvalho de Santanabull;Lucillia Rabelo de Oliveira Torresbull;Fernanda Branco Shinagawabull;Ana Mara de Oliveira e Silvabull;Luciana Tedesco Yoshimebull;Illana Louise Pereira de Melobull;保罗塞尔吉奥马塞利尼bull;豪尔赫曼奇尼菲尔霍

摘要： 采用响应面法优化了黄西番莲果种子抗氧化多酚化合物的固液萃取条件，提取方法如下参数：提取时间（12.8-147.2分钟），乙醇浓度（13-97％）和温度（16.4-83.6℃）。通过2,2-二苯基-1-苦基肼基自由基清除活性，氧自由基吸收能力，beta; -胡萝卜素漂白试验和铁还原抗氧化能力测定评估的多酚含量和抗氧化能力被认为是因变量。因变量的关联解释了在0.88-0.96的确定系数范围内自变量的影响。 通过建立了多酚含量和抗氧化能力的中等至强相关性，并且使用优化的条件来最大化该响应。使用70％乙醇浓度在80℃进行提取30分钟，这是获得具有高浓度多酚化合物和浓度高的提取物的最有效条件抗氧化能力。通过液相色谱 - 电喷雾电离串联质谱（3.68g / 100g种子干基）确定了主要化合物白皮杉醇。这些结果加强了农业工业废物作为生物活性化合物的来源的潜力，对人类健康以及食品和化学工业都有影响。

关键词：Passiflora edulis Sims; 农业工业废物多酚提取物; 白皮杉醇; 响应面法

介绍

黄西番莲是一种热带水果，在国际市场上引起了相当大的轰动。由于其独特的感官特性，巴西生产的大约一半黄色百香果被用于制造果汁。将近25％的果实由果肉组成，工业榨汁过程产生大量的副产品，这通常被认为是浪费的行为。所以日前利用整个水果，重复利用农业工业废物以获得用于工业的新产品和/或原材料的趋势日益增加。

在这种情况下，探索黄色百香果种子虽然规模较小，但在巴西是一个农工业现实。YPFS富含多不饱和脂肪酸，主要是亚油酸和其他生物活性产品，从油提取得到的脱脂面粉用于各种工业，如化妆品（去角质）和食品（冰块）（奶油和酸奶）或掺入动物饲料中。另外，YPFS中的其他组分和抗氧化分子具有工业重要性，来自水果和蔬菜的生物活性化合物一直备受关注，因为这些化合物具有健康益处，例如防止慢性非传染性疾病的发展，可能与它们的高抗氧化剂含量有关。有趣的是，与可食用部分相比，水果和蔬菜副产品含有较高浓度的多酚，并具有强抗氧化能力。

生物活性化合物可以通过不同的萃取技术来回收，例如，溶剂萃取或超声波、超临界流体和高压技术(Khoddami et al.2013)。传统的固液溶剂萃取是典型的，因为它既简单又经济。

在萃取效率、溶剂、萃取时间、温度等因素的影响下，研究的因素较多。至关重要的是要考虑到每个因素在提取中的作用并不一定总是明显的，并且每个食物基质与溶剂在不同的方式中相互作用。因此，必须优化提取参数，以最大限度地降低生产成本，最大限度地提高产品产量。

响应面法(RSM)是一种用于优化复杂过程的统计建模技术，它被广泛应用，因为它允许更有效的数据安排和结果解释。RSM是有利的，因为它减少了试验的数量，以评估在独立变量和它们之间不同的水平组合的结果的相互作用。

材料和方法

1. 原材料

来自果汁加工行业的YPFS由Extrair-Oleos Naturais（巴西里约热内卢）提供。种子经过消毒、冻干，并在- 20c的聚乙烯容器中储存，直到进一步分析。

2.原材料的化学特性

官方分析化学家协会推荐的方法被运用于确定最接近的组成，并且结果表示为以干基计的样品（db）的g / 100g样品。采用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）分析矿物质含量。 ICP-OES在以下条件下运行：等离子气体，辅助流量和雾化器的流量分别为15,1.50和0.68L/min。结果表示为每100g样品的mg（db）。根据方法996.06（通过酸水解将脂肪酸萃取并转化为它们相应的脂肪酸甲酯（FAME）来测定脂肪酸特征2002）。通过将保留时间与从FAME的标准混合物获得的保留时间并使用Ce 1h-05方法。 结果单位表示为g/100g（％）的油。

提取程序

根据Swain和Hillis(1959)提出的使用乙醇-水溶液、温度和时间维持常数的方法提取抗氧化生物活性化合物，在实验设计中选择。所有实验的固/液比固定在1/10(w/v)，并在恒温槽中进行萃取。在提取完成后，溶液在700转/分钟的离心率下进行15分钟的离心分离，并在真空中过滤出上清液。并允许在10毫升的烧瓶中加入萃取液。提取出的产量是用g/100 g (db)的g/100表示的。

总多酚含量

根据Swain和Hillis报道的方法，使用Folin-Ciocalteu试剂测定总酚含量（TPC）（1959）。 TPC表示为没食子酸当量（GAE/100g种子（db）的g。

总黄酮含量

根据Zhishen等人提出的方法估算总黄酮含量C）。并且TFC表示为每100g种子（db）的儿茶素当量（CAE）的g。

抗氧化活性分析

根据Moreira和Mancini Filho(2003)的方法，对b-胡萝卜素漂白assay(BCB)进行了研究。初始和最终的吸光度(Abs)为470 nm，结果表示为抗氧化保护的百分比。

根据Oyaizu报道的方法，采用铁还原/抗氧化能力（FRAP）测定和评估提取物的还原能力（1986），稍作修改。对l-抗坏血酸的标准校准曲线(0.2-1.25 lg/lL)进行了计算。

根据Brand-Williams等人提出的方法对1,1-二苯基-2-吡咯酰肼(DPPH)自由基清除活性进行了评价

在自动酶标仪（Synergy HT，BIOTEK，佛蒙特州，美国）上用2,2-偶氮二（2-脒基丙烷）二盐酸盐（AAPH）作为氧自由基吸收容量（ORAC）过氧化氢自由基产生剂，Trolox作为标准品，荧光素作为荧光探针（Prior et al。2003）。利用荧光衰减曲线下的净面积计算最终的ORAC值

在优化步骤中，测试单一浓度的提取物的抗氧化能力，结果表示为清除的百分比，1g酸抗坏血酸当量（AAE/ 80lg提取物db，防护氧化的百分比和1mu;MTrolox当量（TE）/80mu;g提取物db用于DPPH，FRAP，BCB和ORAC测定，分别为了表征优化的提取物，计算半数最大有效浓度值以表达由DPPH（提取50％DPPH自由基所需提取物的浓度）和BCB（浓度所需提取物以防止50％的总氧化）测定。对于ORAC和FRAP分析，结果表示为1mol TE/g干燥提取物和1g AAE/g干燥分别提取。

对白皮杉醇的HPLC-DAD和LC-ESI-MS / MS分析

首先，将10mL提取物通过固相萃取在用甲醇预处理的柱（Hypersep C18，Thermo Scientific）中纯化（Arabbi et al。2004).定量通过HPLC色谱在270和370nm监测。使用标准白皮杉醇的校准曲线进行定量，结果表示为g白皮杉醇/100g样品db。

使用连接到离子阱质谱仪（Bruker Daltonics，Amazon speed，ETD，德国）和电喷雾电离界面（ESI）的液相色谱（LC）装置进行鉴定。分离条件与用于定量的分离条件相同（Arabbi et al。2004）。质量检测器被编程为在m/ z100和1000之间执行全面扫描，以正负电离模式（4500 V）运行。通过比较通过标准获得的质谱和保留时间来进行芸香醇的鉴定。

实验设计和统计分析

提取条件通过RSM优化。 采用三个因素（2）进行中心复合设计，其中包括8个阶乘点的实验（com-在-1和-1水平的组合），在轴向点的六个实验（水平-a和alpha;a的组合）以及在中心点（0）的四个实验，总共18个测试。

温度，时间和乙醇浓度是自变量。表1总结了每个变量的既定水平，编码和实际值。

以DPPH，FRAP，BCB和ORAC测定的提取干物质（EDM），TPC和抗氧化能力的总含量被用作因变量。

阶乘组合设计生成数学模型，并将其调整为二阶多项式方程。对于每个响应变量，预测的响应函数（Y）被分成相互作用的二次和线性组成部分。

phy（Hewlett Packard 1100）配备有自动进样器和耦合到二极管阵列检测器的四元泵。在C18柱（Luna，Phe-nomenex，Torrance，CA，USA）上进行分离。 流动相由溶剂A（98％水，2％四氢呋喃，（10分钟），15％B（2分钟），25％B（2分钟），80％B（3分钟）和0.1％三氟乙酸）和溶剂B（乙腈）和10％B（3分钟），流速为1毫升/分钟，25℃。 运行是在270和370nm监测。使用标准白皮杉醇（Sigma Chemicals Co.，St.Louis，MO，USA）的校准曲线进行定量，结果表示为g piceatannol/100g样品db。

使用连接到离子阱质谱仪（Bruker Daltonics，Amazon speed，ETD，德国）和电喷雾电离界面（ESI）的液相色谱（LC）装置（CBM 20A，Shimadzu，日本）进行鉴定。分离条件与用于定量的分离条件相同（Arabbi et al。2004）。质量检测器被编程为在m/ z100和1000之间执行全面扫描，以正负电离模式（4500V）运行。通过比较通过标准获得的质谱和保留时间来进行芸香醇的鉴定。

其中b是常数，b是线性系数，b是二次商，b是i和j的变量相互作用系数，X和X TF174）是独立的变量。

通过评估缺乏拟合，Fisher检验（F值），方差分析和与其标准误差有关的系数的t检验来确定由自变量的相互作用产生的二次模型的充分性。模型的统计显著性在5％概率水平下确定（a=0.05）。响应曲面图使用预先获得的用于调整后的模型的值。为了确认所有因变量的数学模型的预测，使用RSM优化的参数进行实验。测量是在一式三份，结果用平均值plusmn;标准差表示。 Pearson相关性用于评估变量反应之间的关联程度。所有分析一式三份使用Statistica 7.0（Statsoft Inc.，Tulsa，OK，USA）进行。

结果与讨论

YPFS的化学成分

碳水化合物和多不饱和脂肪酸是YPFS的主要成分，其中亚油酸是其主要类型（Table2）。我们的结果与其他作者报道的类似发现（67.4-77.2％）相当（Leao et al。2014）。由于高浓度的脂质和脂肪酸类型，YPFS在商业上可用于提取油，可用于化妆品，化学和制药行业（Malacrida和Jorge2012; 洛佩斯等人。2010).

就矿物质含量而言，YPFS含有显着浓度的磷，钙和铁。因此，YPFS可以对推荐的每日摄入量有显着贡献（医学研究所2001）这些矿物质。成年男子（19-70岁）每天食用10克干种子粉分别相当于铁，钴和铬的9.1％，9.9％和80％。

提取优化

统计方法，如与RSM相关的析因设计，已被广泛用作优化食品基质中各种化合物提取的工具，具有高抗氧化能力（Lai et al。2014）。根据2因子设计提取YPFS的实验和预测结果可以在补充材料中找到。

表2西番莲Sims种子的化学表征