苹果的酚类化合物根皮素丙烯醛诱导毒性的试管内衰减

Qin Zhu a,b, Natalie Qi-shan Zhang c, Chi Fai Lau c, Jianfei Chao b, Zheng Sun b,

Raymond Chuen-Chung Chang c, Feng Chen d, Mingfu Wangb,

摘要

在目前的研究中，根皮素在丙烯醛氨基酸蛋白质和细胞模型中的保护作用进行了研究。结果发现，形成FDP-赖氨酸（典型丙烯醛赖氨酸加合物）被根皮素强烈抑制，而其余电子部位在FDP赖氨酸也被根皮素抑制。此外，发现将通过根皮素直接获取的对羟基化合物的抑制作用的丙烯醛掺入BSA和低聚RNA蛋白质.接着，丙烯醛减少LDH在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的释放，表明根皮素的细胞保护作用。这种保护可能会因为抑制增加细胞蛋白质羰基水平而被抑制，这些在Western印迹分析所揭示。本研究强调了一个苹果酚类化合物，根皮素作为预防或治疗丙烯醛有关的人类疾病很有把握的一种选择。

1.简介

自由基和氧化剂引发的脂质过氧化反应可能会导致很多反应性羰基物（RCS）的产生，包括-2-丙烯醛（丙烯醛），4-羟基（HNE），丙二醛和乙二醛（Esterbauer，Schaur，＆左纳，1991）。在生理系统，这些RCS可以通过羰基化和羰基化产物共价修饰蛋白质，这些生物分子称为高级的lipoxidation终产物（ALES）（Negre-Salvayre，Coatrieux，Dagueneau，＆Salvayre，2008）。ALES的形成和积累可能由于病理的原因逐步导致蛋白质功能障碍。 因此，寻找可能的ALE抑制剂日益受到关注。在这些ALEs的前体细胞RCS，丙烯醛是所有涉及的不饱和醛中最具有活性的亲电子。同时出现的在一个共轭C@C–C@O系统，两个反应活性部位的(一个C@C和一个C@O group)，丙烯醛参与了和许多生物亲核物质的温和反应。丙烯醛的潜在目标之一是蛋白质。该巯基半胱氨酸，氨基赖氨酸和组氨酸的咪唑部分被认为是主要的蛋白质和丙烯醛缀合的亲核位点（Witz的，1989）。此外，丙烯醛为初始接合蛋白能产生含有新的亲电中心，可能参与进一步的有害反应的分子内和分子间的交联形成新的蛋白质加合物（Burcham，方丹，kaminskas，彼得森和派克，2004）。特别是，根据Uchida等人的研究，在细胞分子的赖氨酸等含蛋白质的氨基可以修改fi由丙烯醛与NE的形成加合物（3-formyl-3,4-dehydropiperidino）赖氨酸（FDP赖氨酸），丙烯醛赖加合物的鉴定人低密度脂蛋白（LDL）（内田等人，1998）。为特定的检测FDP赖氨酸抗体的后续发展成为蛋白结合丙烯醛的测量的一种重要方法，已广泛应用于研究丙烯醛的贡献，阐明了疾病的病因阳离子（calingasan，内田，吉普森，1999）。如今，丙烯醛被证明是参与介导某些人类疾病，包括阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、外伤性脊髓损伤，糖尿病（calingasan et al.，1999；哈曼等人，2008；勇et al.，2010）。

努力改善丙烯醛的毒性，药理作用备受关注，近年来随着工作作为亲核试剂直接清除丙烯醛的一些化学药物的发展（埃利斯，2007）。到目前为止，有丙烯醛清除性能的化合物主要是含巯基的亲核试剂（半胱氨酸及其衍生物、巯基乙烷磺酸，和硫辛酸）和含氨基的亲核试剂（肼屈嗪及其衍生物、肌肽、吡哆胺，等）（aldini，达勒多恩，facino，milzani，amp;卡里尼，2007）。最近，丙烯醛清除剂的范围已扩展到自然来源包括来自苹果根皮素和根皮苷和来自茶儿茶素类化合物（Zhu et al.，2009A，2009B；朱、孙、江、陈、王，2011）。所有这些天然酚类化合物中，phloretinwas建议作为最有效的清除机制及其在模拟生理条件下成立（Zhu et al.，2009b）。基于化学模型的结果，酚类化合物对丙烯醛蛋白或细胞保护作用的挑战要求作进一步调查。

在本文中，我们假设，根皮素的直接丙烯醛标靶能力可能有助于保护作用的蛋白质或细胞暴露于丙烯醛。为此，na-acetyl-l-lysine应用与丙烯醛反应证明LC MS分析–根皮素可抑制赖氨酸残基的修饰。牛血清白蛋白（BSA）和牛胰核糖核酸酶（RNase A）来显示根皮素对引起蛋白质羰基化蛋白交联丙烯醛的抑制作用，分别。此外，生物相关性进行了探讨。作为一个大量的证据表明，丙烯醛是一种神经毒素，导致阿尔茨海默病的病理学（2003 pocernich amp;amp;巴特菲尔德），一个流行的神经变性细胞模型，对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，是当前研究的预防从丙烯醛的毒性作用的根皮素的研究。释放的乳酸脱氢酶（LDH）被用来评估了暴露在丙烯醛根皮素的保护作用。此外，由于蛋白质羰基化反应是细胞存活的关键，细胞蛋白质羰基含量也进行了分析。

2. 原料与方法

2.1. 化学原料

丙烯醛，乙酰基-L-赖氨酸，根皮素，牛血清白蛋白（BSA）的标题，二甲基二甲基亚砜（DMSO），二硝基苯肼（2,4 -二硝基苯肼，吡哆胺，三氯乙酸酸，盐酸胍），磷酸缓冲盐水（PBS缓冲液，pH值为7.4米，从牛胰核糖核酸酶A的），和马斯亮蓝G250）公司获得来自全sigma–aldrich（圣。路易斯，MO）。所有的分析和高效液相色谱级溶剂是从默克公司（普尔，英国）采购而来。材料用于细胞培养的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的最小基本培养基（MEM）等，青霉素，链霉素，L -谷氨酰胺，牛血清（FBS）和来自全（伯灵顿），加拿大。检测试剂盒是由罗氏诊断（曼海姆，德国）采购得来。oxyblottrade;蛋白氧化检测试剂盒是从生物细胞中心（圣地亚哥，CA）得来。聚偏氟乙烯（PVDF）膜是从（里士满，CA）和生物膜从柯达的X -射线（东京，日本）采购。喷雾展台的ECL 检测系统为辉公司。

2.2. 液相色谱-质谱（LC MS––FDP）的赖氨酸的形成分析

反应混合液（1毫升）含丙烯醛（2mM）和na-acetyl-l-lysine（1mM），在根皮素的缺乏或存在（1毫米）的情况下在PBS（0.01 M，pH 7.4）在37 C进行 24小时孵育。 在孵育后，过滤后的样品在配备有电喷雾电离分析（ESI）源连接到一个api2000-qtrap质谱仪（Applied Biosystems，协和，加拿大）色谱仪器下分析。液相色谱是安捷伦高效液相色谱系统由脱气器进行（g1379a），季泵（g1311a），恒温自动进样器（g1329a），和二极管阵列检测器（g1315b）。反应产物在一个反相Phenomenex中分离（Torrance，CA）月18（2）柱（150 2毫米，5流明）。流动相为水（0.1%甲酸）-乙腈（ACN）与0.2毫升/分钟。水/乙腈的初始比例流量梯度为95:5，并保持10分钟，然后线性增加至10:90在接下来的25分钟的总运行时间为35分钟，为柱平衡后的运行时间为15分钟。MS操作参数如下：正离子模式；喷涂电压4 kV；扫描范围，200–1000大；离子源温度，由分析师1.4.2软件进行数据采集与分析300 C（Applied Biosystems，Foster City，CA）。

2.3. 羰基结合法

羰基掺入法测定根据Uchida等人的方法进行。（1998a，1998b）小迪fi阳离子。布里flY，BSA（1毫克/毫升）孵育与丙烯醛（1毫米）在PBS（pH 7.4）在37 C 24 H在根皮素的缺乏或存在（1毫米和2毫米）。吡哆胺（2 mm）作为阳性对照。利用DNPH作为衍生剂测定蛋白质羰基含量。反应混合物的等分（0.5毫升）分别与等体积的0.1%的治疗（W/V）在2 M HCl溶液孵育DNPH在黑暗中在室温1小时，三氯乙酸（0.5毫升，20% W / V，fiNAL浓度）加到沉淀蛋白质。离心后，沉淀物三次提取乙醇/乙酸乙酯（1:1，V/V）直到上清液无色。最后，蛋白质样品用8 M盐酸胍和紫外吸收1毫升溶解在365 nm在uv-1206分光光度计测定（日本岛津公司，日本）。

2.4. RNAA低聚阻断试验

根皮素的疗效引起蛋白质交联丙烯醛抑制剂被RNase A低聚阻断试验检查，根据Burcham和派克（2006）轻微的修改。简而言之，通过反应制备测定衬底的核糖核酸酶A（2.1毫克/毫升）与3.2毫米丙烯醛在Eppendorf管2 ml PBS在37 C 190将被拆除，等分加0.2毫升聚合酶链反应管含有25或50毫米，将10根皮素（预先溶解在DMSO），实现各自的根皮素1.25毫米和2.5毫米的浓度。反应后没有进行丙烯醛被用来验证根皮素将有RNase A低聚的推论。吡哆胺（2.5 mm）作为阳性对照。反应可以进行6小时37℃，反应后的混合物稀释3:1 5将样品缓冲液和加热。含蛋白质的LG 30等分然后在12.5%分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白寡聚的特点是通过考马斯亮蓝染色。

2.5. 细胞培养与治疗

人类神经母细胞瘤SH-SY5Y（通道lt;20）来自ATCC（马纳萨斯，弗吉尼亚）培养的培养基10%热灭活胎牛血清、谷氨酰胺（2毫米）、青霉素（50单位/毫升），链霉素（50 LG电子/毫升）37度在一个人工 5%二氧化碳培养箱。所有的处理进行，当细胞密度达到80%浓度的影。根皮素原液（50毫米）的制备在DMSO和DMSO（车辆单独治疗中最大浓度0.5会/毫升）没有影响细胞生长。在治疗时，切换到无血清培养基MEM使用抗生素。SH-SY5Y细胞孵育的根皮素（5，10和25的LM）之前的1小时暴露于丙烯醛。新鲜制备的MEM培养基中每天使用前是丙烯醛溶液。本研究中使用的丙烯醛浓度为10流明，它等于3.5 nmol/mg蛋白对细胞蛋白质平均浓度的计算。根据文献（安萨里，凯勒，amp;amp;雪夫，2008），在阿尔茨海默病患者大脑体内丙烯醛的浓度约为2.5 nmol /毫克的杏仁核和5 nmol / mg在海马旁回。因此，本研究中使用的丙烯醛的浓度是阿尔茨海默病相关的病理条件下的观察。

2.6. LDH释放

LDH活性测定进行评估的一般毒性据何等人。（2010）。简略的讲，细胞进行培养和处理在24孔板中，收集上清，24 h后暴露于丙烯醛。无细胞培养基孵育后在室温下，在黑暗中30分钟的检测试剂在592 nm波长处用分光光度仪测量吸光度测定LDH的释放。结果（1为每个样本）表示为控制褶皱。

2.7。细胞蛋白羰基水平

用于通过丙烯醛引入蛋白质羰基的测定，细胞生长于6孔板和暴露丙烯醛2小时后收获到与/无预处理1小时根皮素的。如别处所述，总细胞裂解物被收集（Yu等人，2007）。简要地，细胞在冰冷的裂解缓冲液（10 mMTris-盐酸; pH值7.4），1mM的氯化钠，的20mM Na4P2O7，2毫Na3VO4,1％的Triton-X-100，10％甘油，0.5％脱氧胆酸盐，0.1 ％的SDS，1mM苯甲磺酰FL uoride，蛋白酶抑制剂混合物，以及磷酸酶抑制剂混合物）。均化和离心后，收集含有可溶性蛋白质的上清液。蛋白质羰基分别与OxyBlottrade;蛋白质氧化检测试剂盒进行检测。简言之，将待分析每个样品的两等份，当一个进行衍生化反应，而另一个作为阴性对照（取代的DNPH衍生控制溶液进行处理）。蛋白质样品变性，加入12％SDS等体积的最终浓度6％的SDS。衍生化过程，然后在室温下15分钟进行，并通过加入中和溶液终止。两个处理的样品和阴性对照装入12.5％聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质分离后，阴性对照的凝胶通过考马斯蓝染色。同时，含有衍生样品另一个凝胶转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。非特异性绑定阻断培养，用5％在TBST（重量/体积）脱脂乳轻轻摇动1小时（含0.1％Tween-20的Tris缓冲盐水（pH 7.4））。此后，将膜用初级兔抗DNP抗体在室温下培养1小时（1:150）。洗涤后，将膜与二级山羊抗兔IgG抗体（HRP缀合）抗体（1：300），培养1小时。随后，所有频段都在百玛士透视网络通过可视化开发的喷雾和​​灼热ECL Western印迹检测系统检验。

2.8。 统计分析

统计分析进行了使用SPSS13.0统计软件包（SPSS公司，芝加哥，IL）。配对样本t检验用于测定与相应的对照组相比是否有一个显着的差异（P lt;0.05）。

3。结果与讨论

3.1。对赖氨酸残基的修正

赖氨酸残基是进行丙烯醛共轭（袁，朱，与塞尔2007年）最常见的蛋白质的残基，

;因此，钠乙酰基-L-赖氨酸被选为一个原型，探讨丙烯醛对天然蛋白质改性。丙烯醛与赖氨酸的ε-氨基团反应，形成FDP的赖氨酸和参与由内田等人被合理解释的机制。首先，丙烯醛易在双键（C-3）受核苷亲加入赖氨酸氨基，在丙烯醛的醛基仲胺衍生物的保留和形成。

这种不稳定的中间产物会通过迈克尔加成与另一丙烯醛分子进一步反应，生成亚胺衍生物。最后，经过羟醛冷凝和脱水，该反应完成，形成FDP赖氨酸衍生物（Uchida等人。，1998年）。要中断FDP赖氨酸形成，丙烯醛清除剂应该在丙烯醛附着于氨基酸之前阻止。在我们的研究中，FDP赖氨酸的形成通过LC-MS分析监控。该反应混合物的总离子色谱图（TIC），其所含的Na乙酰基-L-赖氨酸（1 mM）和丙烯醛（2毫mM）表明在1.97分钟的保留时间明显FDP赖氨酸高峰，如图1A（A）。其分子量（[M H] M / Z =283.2）与相应于加合物的分子组成相匹配，钠乙酰基-L-赖氨酸的一个分子和两个分子丙烯醛之间进一步脱水形成。 FDP-赖氨酸的产生进一步在赖氨酸残基存在时，用于根皮素的诱捕能力测试。在包含根皮素反应混合物的TIC（1 mM，同时添加用Na乙酰基-L-赖氨酸和丙烯醛），我们发现

FDP赖氨酸的离子峰不存在。相反，丙烯醛的加合物与根皮素

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