石榴皮甲醇提取物的抗菌、抗氧化

以及酪氨酸酶活性抑制的研究

原文作者 Olaniyi A Fawole, Nokwanda P Makunga and Umezuruike Linus Opara1*

摘要：背景：本研究用体外测定法评估七个商业化种植品种的石榴果皮甲醇提取物，在抗菌、抗氧化、和酪氨酸酶活性抑制方面的作用。

方法：研究使用微量稀释法检测了革兰氏阳性（枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性细菌（大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌）的抗菌活性，对一些潜在的抗氧化活性，包括自由基清除能力（RSA），亚铁离子螯合（FIC）和降低铁离子抗氧化能力（FRAP）进行了评价。实验中研究了针对单酚（酪氨酸）和二酚（DOPA）的酪氨酸酶抑制作用，并采用熊果苷和曲酸作为阳性对照。此外，使用比色方法测定了酚含量中总黄酮含量（TFC），单宁含量（GTC）和总花青素含量（TAC），并且对甲醇提取物中酚类成分进行HPLC-ESI/ MSN分析。

结果：果皮甲醇提取物对革兰阳性和革兰氏阴性细菌表现出很强的广谱活性，其最小抑制浓度（MIC）范围为0.2至0.78毫克/毫升，并且在最大测试浓度（1000微克/毫升）中，清除自由基的活性是显著高于Arakta（83.54％），加尼甚（83.56％），和Ruby（83.34％）品种（P lt;0.05）。所有品种果皮的提取物都表现出对FIC和FRAP活性的剂量依赖性。所有的提取物还在单酚酶和二酚活性最高筛选浓度中，具有很高的抑制性（gt; 50％）。最有活性的果皮提取物分别是抗单酚的Bhagwa品种和抗二酚的Arakta品种，在IC 50值时分别为3.66微克/毫升和15.88微克/毫升。在果皮提取物中发现了大量的酚类化合物，其中最高和最低的总酚含量分别是295.5毫克/克（Ganesh）和179.3毫克/克的干提取物（Molla de Elche）。所有品种中均发现含有儿茶素，表儿茶素，鞣花酸，没食子酸，其中鞣花酸于每个品种总酚类化合物中均有检出，含量超过50％，是最丰富的。

结论：目前研究显示，测试的石榴果皮均表现出很强的抗菌、抗氧化和酪氨酸酶抑制活性。这些结果表明，石榴果皮可被开发作为天然的抗微生物剂和抗氧化剂以及酪氨酸酶抑制剂的潜在来源。

关键词：抗菌活性，酪氨酸酶抑制，酚类，石榴，南非

大量流行病学研究表明，富含植物化学物质和抗氧化物的食物能防御疾病，维护健康。这些天然抗氧化剂在治疗与氧化应激有关的退行性疾病如癌症、心血管疾病、糖尿病、阿尔兹海默氏症以及衰老的过程中起重要作用。抗氧化性植物化学物质，尤其是存在于水果及蔬菜中的酚类化合物，因其在预防人类疾病中的巨大潜力而日益受到重视。

石榴（石榴属，石榴科）因其多种功效及营养作用而在近几年流行开来。它富含单宁和其他生物活性成分，其中的酚类化合物据报道能降低疾病风险。石榴果皮占总重的50%，却往往作为废物被丢弃，而相较于果汁，果皮中含有的酚类物质更多，且生物活性更高。研究表明，在清除超氧阴离子、羟基、过氧自由基和抑制由CuSO4引起的LDL氧化反应方面，石榴皮提取物的抗氧化能力远高于果汁提取物。除了较高的抗氧化能力，石榴皮提取物还被报道具有光谱生物学作用，如抗肿瘤、抗菌、止泻、抑制细胞凋亡、抗基因毒性、抑制酪氨酸酶活性、消炎和抗糖尿病作用。果皮中的聚苯酚化合物，如鞣花单宁、黄酮醇、花青素、儿茶素、原花青素、鞣花酸和没食子酸具有各种药理作用。然而，这些石榴皮提取物的含量因石榴的品种不同而呈现差异，并表现出不同的生理活性。

在南非，有十余个石榴品种得到了商业化种植。但目前为止，对于在南非气候条件下种植的石榴品种，其果皮生物活性尚无可靠资料可寻。如果某些品种的石榴皮在促进人体健康方面存在潜力，在果品加工过程中则应对其利用率予以提高。为了推动具有保健作用的功能性食品的发展，我们利用体外实验研究了在南非西开普省进行商业种植的七种品种的石榴果皮的抗菌、抗氧化和抑制酪氨酸酶活性的作用。此外还对总酚含量，包括类黄酮、单宁和花青素含量以及个别酚类物质进行了定量。

1 方法

1·1植物原料

本研究使用了在南非进行商业种植的七个品种（Arakta, Bhagwa, Ganesh, Herskawitz, Molla de Elche, Ruby, and Wonderful）的石榴皮，石榴主要从西开普省的一家石榴包装厂购得，且主要于2010年2月至5月间收获，由纸板盒包装，通过空调车运输至采后研究实验室。原料一经到达，即从每个品种中取十个进行清洗并手工去皮。之后对石榴果皮进行冷冻干燥、研磨成粉状并储存在密闭容器中，于7℃下避光保存。

果皮提取物的制备

取每一品种的石榴果皮粉末样品（2g）分别用10毫升80%（体积/体积）的甲醇（MEOH）和蒸馏水（水溶液）通过超声处理1小时进行萃取。在真空条件下用Whatman 一号滤纸对萃取液进行过滤，再用同样方法对残留物进行进一步萃取。将萃取液于气流中进行风干，首先对其进行抗菌试验以确定可以对哪种萃取液做进一步的药理学研究实验。结果显示只有甲醇提取物表现出最高的抗菌活性，因此只对其进行其他实验。

1·2抗菌性能

1·2·1微量抗菌实验

果皮提取物的抗菌试验采取了Fawole et al 所述的微量稀释抗菌试验以测定其最低抑菌浓度（MIC），所不同的是，本试验中样品的初始浓度(50mg/ml)是通过用80%(v/v)的甲醇溶解干燥的萃取物而得到的。本试验使用了两种革兰氏阴性细菌（大肠埃希氏菌ATCC11775和肺炎克雷伯菌ATCC13883）和两种革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌ATCC6051和金黄色葡萄球菌ATCC12600）。将萃取液用无菌蒸馏水连续稀释两倍，在96孔微量板中一式三份，与上述四种细菌反应。用链霉素（0.1毫克/毫升）作为阳性对照，用相同条件下的水和无菌肉汤作为阴性对照。此外，甲醇还起到检查假抗菌活性的作用。石榴提取物的最终浓度从0.097 - 12.5mg/ml不等，测试的提取物的甲醇减少量在0.19到20％，而链霉素减少量为0.78和100微克/毫升之间。

1·2·2自由基清除能力

清除稳定自由基，如1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）的过程是公认的抗氧化机制。Karioti et al 等人在报道中使用的是一式三份的DPPH法，即把不同浓度的提取物一式三份（10，100和1000微克/毫升）进行自由基清除测试，再将提取物的清除活性与抗坏血酸（1000微克/毫升）进行比较。 在相同条件下用空白甲醇替代测试样品或抗坏血酸。自由基清除反应可通过DPPH溶液脱色来指示，主要遵循以下公式：

RSA（100%）=[1-(Atest/Ablank)x100] (1)

其中Atest是反应混合物(含标准的抗氧化剂或提取物)的吸光度，Ablank是空白试验的吸光度。

1·2·3亚铁离子螯合剂（FIC）测定
采纳了Singh和Rajini的[33]FIC活性测定。简言之，将0.1 mM硫酸亚铁（0.5ml）与不同浓度（10，100和1000微克/毫升）的提取物（0.5ml）混合，一式三份，随后加入0.25mM菲洛嗪（1ml）。将反应混合物温育10分钟， 在562nm处测量吸光度值（A），将抗坏血酸（1000微克/毫升）作为阳性对照。在相同的条件下设置含甲醇替代测试样品或抗坏血酸的空白试验。提取螯合亚铁离子能力使用下面的等式进行计算：

Chelating ability（100%）=[(Ablank-Atest)/Ablank]x100 (2)

其中Atest是反应混合物(含提取物或抗坏血酸)的吸光度, Ablank是空白试验的吸光度。

1·2·4三价铁离子降低抗氧化能力（FRAP）法

提取物的还原力是根据Benzie和和Straino的报告中的比色法进行了一些修改后检的。一式三份，甲醇提取物（150微升）在不同浓度（10，100或1000微克/毫升）下加入到2850mu;l FRAP溶液（由300 mM乙酸盐缓冲液构成），50ml;10mM2,4,6-tripyridyl-s-triazine（TPTZ），5ml，和20mM氯化铁，5ml。按照同样的步骤，设置含80％甲醇替代提取物的空白试验，而相同的条件下10mu;g/ ml的水溶性维生素E作为阳性对照。将反应混合物在黑暗中培养30分钟。Fe3 -TPTZ络合物的还原与提取物的Fe2 -TPTZ络合物的着色是通过使用Helios Omega UV–vis spectrophotometer (Thermo Scientific technologies, Madison, USA)在593nm处测量吸光度值监测的。反应混合物的吸光值从最初的空白读数到检测到的变化认为是FRAP活性。

1·2·5酪氨酸酶抑制性

据Momtaz等人的描述，酪氨酸酶抑制的活性取决于L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA，Sigma）和酪氨酸作为底物。样品溶解在浓度为20毫克/毫升二甲亚砜（DMSO）中，并进一步稀释于600微克/毫升的磷酸钾缓冲液（50mM，pH6.5）中，使用在96孔微量滴定板和一酶标仪FC板读数器（Thermo Scientific技术，中国）中测定。所有测定中的步骤均在室温下进行。一式三份，取各制备的样品（70微升），加入30微升酪氨酸酶（在磷酸盐缓冲液333单位/毫升，pH6.5）中混合。温育5分钟，将110mu;l底物（2mM的L-酪氨酸或12mM的L-DOPA）加入到反应混合物中，并进一步温育30分钟。该提取物的最终浓度为2.6 - 333.3微克/毫升。熊果苷（1.04 - 133.33微克/毫升）作为阳性对照，而空白实验为每一样本所具有的所有成分，除了L-酪氨酸或L-DOPA。结果与控制含有的DMSO替代实验样品进行了比较。然后在492nm处测定吸光度值。酪氨酸酶抑制率计算如下：

%inhibition=[(Acontrol-Asample)/Acontrol]x100 （3）

其中Acontrol是DMSO中的吸光度， Asample为含有提取物或熊果苷的测试反应混合物的吸光度。计算提取物的IC 50值和熊果苷。

1·2·6酚含量测定

总酚含量（TPC）

总酚（TP）的含量是用由Makkar修改的Folin-Ciocalteu (Folin-C.)的比色法来测定的，并以没食子酸每克DM来等价计算（GAE）。

1·2·7总黄酮含量（TFC）

总黄酮含量（TFC）用由杨等人[38]描述的方法测定，结果用为儿茶素当量（CAE）每克DM表示。

1·2·8 Rhodanine对单宁含量的测定（GTC）

用Makkar所说的方法对从甲醇提取物中提取的单宁含量进行测定。样品（50微升）与600微升rhodanine混合后再加入150微升的0.4N硫酸. 10分钟后，加入200微升的0.5N KOH，2.5分钟后再加入蒸馏水（4毫升）。在520nm（室温）下对反应15分钟后含有含水甲醇中的空白试验组读取其吸光度值。GTC的是从标准曲线（五倍子酸）来计算，并且表示为没食子酸当量（GAE）每克DM。

1·2·9花青素含量（TAC）
用Wrolstad描述的pH差法测定总花青素含量（TAC）。一式三份于各试管中，各提取物（1毫升）溶液与9mlpH为1.0和pH4.5的缓冲液混合。在pH值1.0和4.5缓冲区内，反应混合物的吸光度测定在520和700nm。根据公式4计算总吸光度，而总花青素含量则由等式5计算，结果显示为矢车菊-3-葡萄糖苷。

A=（A510-A700）PH1.0-(A510-A700)PH4 (4)

Total anthocyanin(mu;g/ml)=[(AxMWxDF)/ ε x L)] (5)

A=吸光度，ε= Cyd-3-glucoside molar absorbance（26900），MW =花青素分子量（449.2），
DF=稀释系数，L=细胞path-length（1厘米）。最终结果表示为Cyd-3-glucoside等效（C3gE）每克干物质（mu;g C3gE/g DM）。

1·2·10酚成分的HPLC-ESI/MSn分析

根据Fischer等对石榴皮提取物中酚和花青素成分进行LC-MS分析.[40]，但是稍加修改，使用Synapt G2系统质谱仪UPLCTM系统（Waters Crop，Milford，USA），连接到一个光电二极管阵列检测器和一个BEH C18柱（1.7mu;m粒径，2.1x100毫米，Waters Crop）。

流动相为5％甲酸比水（v/ v）作为洗脱剂A和95％乙腈比5％的甲酸（体积/体积）作为洗脱剂B。流速固定在0.2毫升/分钟，柱温设定在40℃。电喷雾电离（ESI）的探针在正模式以3千伏的毛细管电压下操作;和锥体15 V电压。注射体积为10微升，二极管阵列检测器设定在之间将检测设定在200-600纳米。个别酚类化合物通过用来自Sigma Aldrich（德国）中的相应标准（儿茶素，表儿茶素，原儿茶酸，没食子酸，鞣花酸）获得多点校准曲线进行比较定量分析，而花青素是由外标cyanidin 3, 5-diglucoside进行定量分析（Sigma Aldrich，德国）。lt;

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