不同颜色特征藤茶提取物的抗氧化性能及其对菜籽油和葵花籽油氧化的抑制作用

原文作者 Caihua Jia, Jinghuan Li, Mingxing Zhang, Weibo Ma, Siming Zhao, Ru Liu, Jianhua Rong, Xiaohua Li

单位 Key Laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministry of Education, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei, China（华中农业大学食品科学技术学院，环境相关营养学教育部重点实验室，湖北武汉）

Laboratory of Natural Medicine and Molecular Engineering, Department of Medicinal Plant, College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei, China（华中农业大学植物科学技术学院药用植物系，天然药物与分子工程实验室，湖北武汉）

摘要：有效的抗氧化剂对防止脂质变质至关重要。本文旨在研究藤茶提取物的抗氧化特性，并评价其对脂质氧化的抑制作用。本研究测定了不同叶龄、不同叶色的四种藤茶叶提取物中总黄酮、酚类物质和花青素的含量。此外，通过测定铁离子还原抗氧化能力（FRAP）、DPPH·和bull;OH清除能力以及脂质过氧化抑制能力来评价这些提取物的抗氧化能力。结果表明，四种藤茶叶提取物中，尤其是嫩叶提取物，具有较好的清除自由基和抑制脂质氧化的作用，表明其具有一定的抗氧化能力。与二丁基羟基甲苯（BHT）相比，藤茶叶提取物显著抑制葵花籽油和菜籽油中过氧化值（POV）和硫代巴比妥酸反应产物（TBARS）的增加。这一结果对于寻找延长食品保质期的天然抗氧化剂具有重要意义。

关键词：藤茶； 抗氧化性能； 脂质氧化；核磁共振氢谱（¹H NMR）

1.引言

含有脂类的食品在受热、光照、氧气、水分或酶的作用下会发生酸败或变质，从而导致食品质量下降，并可能产生有毒物质。因此，一些人工抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）和没食子酸丙酯（PG）被用于食品中以抑制氧化和延长食品保质期^[1]。然而，世界对天然抗氧化剂的需求越来越大，因此人们一直致力于探索天然的抗氧化剂成分，以保持食品质量，避免或减少使用人工合成添加剂。

藤茶广泛分布于我国南方山区。它作为一种传统的中草药植物已经发展了数百年。同时，它也被加工成茶产品销售。根据之前的报道，二氢杨梅素是藤茶中的主要化合物，其含量约为干叶的30%^[2]。由于黄酮类化合物含量高，已有研究证明藤茶提取物具有很高的抗氧化活性和清除自由基的能力^[3-5]。此外，一些研究表明藤茶提取物可有效延缓脂质氧化^[6-7]。

绿叶藤茶被广泛用于功能性成分开发或茶叶生产，但红叶藤茶通常被视为废物处理。对不同颜色特征藤茶抗氧化性能的研究很少报道。本研究不仅比较了不同生长期绿叶和红叶藤茶代谢产物的变化规律，而且评价了它们在体外和在油脂体系中的抗氧化能力。对不同颜色藤茶进行综合评价，可为充分利用藤茶资源提供依据。

2.材料和方法

2.1. 藤茶提取物的制备实验用的藤茶叶片样品由湖北省恩施市来凤县一家从事茶叶行业的机构提供。冷冻干燥（扫描速度-40，丹麦）后，用搅拌机（FW-100，中国武汉）将四种叶片样品研磨成细粉，命名为绿色嫩叶（GYL）、绿色老叶（GOL）、红色嫩叶（RYL）和红色老叶（ROL）。6克干燥粉末加入300mL 70%乙醇中，在室温下超声波提取（SB-5200D，中国宁波）30min，然后用布氏漏斗过滤^[8]。残渣经提取，然后过滤三次。之后，蒸发滤液以除去挥发性溶剂，得到浓缩液体样品。此后，再次冻干液体样品以获得粉末。从GYL、GOL、RYL和ROL得到的藤茶提取物质量分别为3.40 g、3.20 g、3.59 g和3.26 g。这些提取物在4℃下保存。

2.2. 组成成分分析

藤茶中主要生物活性化合物为黄酮类和酚酸类化合物^[9]。准确称量10mg提取物溶解在1mL 70%乙醇中进行成分分析。

2.2.1. 总黄酮含量

黄酮类化合物含量（FC）的测定方法在前人的研究中已有描述，采用芦丁标准曲线进行计算^[10]。向10mL试管中加入去离子水，将总体积固定为5mL，加入0.1mL无氢样品，涡旋，并加入150mu;L的5% Na₂NO₂。5min后，向混合物中加入150mu;L的5%AlCl₃，搅拌5 min后加入1mL的1mol/L NaOH。10min后，用分光光度计（xMark，Bio-RAD，美国）测量415nm处的吸光度。结果以芦丁当量（RE）mg/g提取物表示。

2.2.2. 总酚含量

总酚含量（PC）的测定采用了一种改进的酒石酸亚铁比色法^[11]。简而言之，将0.1mL各叶提取物与1.9mL去离子水和2.0mL新鲜制备的酒石酸亚铁试剂混合，然后加入1mL磷酸盐缓冲盐水（PBS, pH 7.5）。室温下反应15min后，在540nm处测定吸光度。用没食子酸绘制标准曲线，以没食子酸当量（GAE）mg/g提取物计算总酚含量。

PC = C times; V₁ times; V₂/（M times; V₃）

M为样品质量；C表示标准曲线上的PC浓度（mg/mL）；V₁、V₂和V₃分别为稀释体积、样品溶液体积和测定过程中吸收的样品体积。

2.2.3. 花青素含量

采用包劲松等^[10]的方法测定总花青素（AC）含量。简而言之，将0.1mL溶液加入到1mL盐酸-甲醇（1：99/v：v）中，在25℃黑暗中振荡18h。离心10min后，取出0.5mL上清液加入到2mL试管中。然后，加入0.5mL去离子水和0.3mL氯仿，涡旋10s进行提取。离心后，从上清液中取出各0.2mL样品，分别在530nm和657nm处进行吸光度读数。

AC由以下公式计算：

AC = （A₅₃₀ - 0.27 times; A₆₅₇）/M

A₅₃₀和A₆₅₇是样品溶液在530nm和657nm的吸光度；M代表提取物的质量。

2.3. 藤茶提取物的体外抗氧化活性评价

2.3.1. FRAP和RPA的还原力分析

采用Li，Shi，和Wang^[12]所述的方法进行铁还原抗氧化能力（FRAP）测定，并稍加修改。制备新鲜的FRAP试剂溶液（10mmol/L TPTZ-1，3，5-三嗪，2，4，6-三-2-吡啶，溶于40mmol/L HCl、20mmol/L FeCl₃和300mmol/L乙酸缓冲液中，pH 3.6，体积比1：1：10）。每个样品取0.5mL和3.0mL的FRAP溶液混合，并置于37℃下10min。在593nm处记录吸光度。

还原力活性（RPA）分析采用铁氰化物/普鲁士蓝法^[13]。简而言之，将2.5mL 0.2mol / L的PBS （pH 6.6）和2.5mL铁氰化钾溶液（1 g / 100 g）加入到1mL 10mg/mL的提取物中，然后将混合物放在50℃水浴中20min。之后，加入2.5mL三氯乙酸（10 g / 100 g），然后以2013g的速度离心10min。取2.5mL上清液与2.5mL去离子水和0.5mL氯化铁（0.1 g/100 g）混合，在700nm处测定吸光度值。

空白溶剂按照样品所述制备，分别使用0.5mL和1mL 70%乙醇作为FRAP和RPA分析中的替代物。上述两种方法的还原能力计算公式为：

还原能力= A_s - A_b

A_s和A_b分别为样品和空白的吸光度值。数据以吸光度值表示。

2.3.2. DPPHsdot;和bull;OH自由基清除率的测定

按照Hes等人^[14]报告的方法进行DPPH检测分析，但进行了少量修改。制备96.4mmol/L 的DPPH自由基溶液，将0.5mL样品溶液与2.5mL新鲜制备的DPPH自由基溶液混合。室温黑暗反应30 min后，记录517nm处的吸光度。对DPPHsdot;的清除能力由以下公式计算：

DPPH自由基清除率（%）= [（A_b - A_s）/A_b] times; 100

其中A_b和A_s为空白对照（不含提取物）和样品的吸光度。

根据经过一些修改后的1,10-菲咯啉/亚铁（II）氧化法^[15]测定了对bull;OH的清除活性。简而言之，将1.0mL 0.7mmol/L的1,10-菲咯啉乙醇溶液、2.0mL 0.75mol/L PBS （pH 7.4）、1.0mL 0.75mmol/L硫酸亚铁溶液和1.0mL 0.12% H₂O₂与1.0mL样品溶液混合。混合物放于37℃下60min，然后在536nm处测吸光度。此外，将样品和H₂O₂分别替换为H₂O作为对照组和损伤组。bull;OH清除活性由以下公式计算：

bull;OH = [（A_s - A_p）/A_b] times; 100%

其中A_s、A_p、A_b分别表示混合物溶液、损伤1,10-菲咯啉溶液和未损伤1,10-菲咯啉溶液的吸光度。

2.4. 商品油的净化

菜籽油（RSO）和葵花籽油（SFO）是从当地超市买的。将其与正己烷混合，用30g木炭、60g凝胶、薄层无水硫酸钠、10g脱脂棉有序填充柱过滤净化。将300 g食用油溶解于500mL正己烷中，以去除油脂中同时存在的抗氧化成分，从而准确评价藤茶提取物的抗氧化活性。

2.5. 汽提油的加速氧化

为了评价藤茶对脂质氧化的作用，在微量氯仿和甲醇（1：1，v/v）的帮助下，将8 g等分的每种汽提油与不同的提取物以200 ppm混合，以提高溶解度。每次处理的汽提油放在无盖培养皿（6cmtimes; 6cm）中，置于40℃暗处。以含有BHT的油作为阳性对照，不含提取物的汽提油作为空白对照。每48h测量POV和TBARS，每个样本重复3次。

2.6. POV和TBARS分析

在一项已报道的研究中测定并计算过氧化物值（POV）^[16]，结果显示为每千克油的毫摩尔数。反映醛类浓度的硫代巴比妥酸反应产物（TBARS）是根据以前的研究进行测量的^[17]。TBARS表示为每千克样品中的丙二醛毫克数（每千克油中的丙二醛毫克数）。

2.7. 核磁共振氢谱（¹H NMR）分析

制备的油样在600 MHz的Bruker Avance III 600光谱仪（Bruker BioSpin Corporation, Billerica, MA, USA）上测定¹H NMR。将600mu;L氯化镉和50mu;L氧化油放入直径为5mm的试管中，对汽提油中的一次和二次氧化产物进行定量分析，如Jia等人2015年所述^[18]。

2.8. 统计分析

藤茶中活性成分的含量、体外抗氧化能力的评估、过氧化值和硫代巴比妥酸反应产物的测定以3次重复的平均标准差表示。结果采用单因素方差分析（ANOVA）和事后多重比较邓肯检验法。有效活性成分与抗氧化活性的Pearson相关性分别为P lt; 0.05*、P lt; 0.01**。本研究使用SPSS统计软件（第21版，适用于Windows，美国伊利诺伊州芝加哥SPPS公司）。

3.结果与分析

3.1. 主要成分分析

在本研究中，我们测定了不同样品，即GYL, GOL, RYL和ROL的FC

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