高效液相色谱法-酸水解法测定大鼠血浆中银杏叶总黄酮成分及药代动力学研究

原文作者 HU Jun , ZHAO Yunan , MA Chao , WANG Weiyu ,

XING Dongming , DU Lijun

摘要：高效液相色谱二极管阵列检测器测定血浆中总黄酮后静脉银杏叶提取物，建立了简单、 可靠、 经济的方法。该方法酸水解和recalcula-化后同时检测槲皮素，山奈酚，异鼠李素，在正交试验法优化了水解和提取的条件。特异性通过比较保留时间，紫外光谱，并与标准峰纯度指数测试。检出限为20毫微克/毫升的槲皮素，20毫微克/毫升的山奈酚和50毫微克/毫升的异鼠李素。校准曲线范围为75-2400，71-2280和70-2240毫微克/毫升。采用两隔室模型银杏黄酮的大鼠的50毫克/公斤的银杏叶提取物的静脉给药后的药动学特征进行了分析。初始血浆浓度为171.22微克/毫升。在第一隔室（分布）黄酮类化合物的半衰期为0.07小时，并在所述第二隔室（消除）为4.51小时，而AUC（0-infin;）为1711.06micro;gbull;min/mL。表观分布容积为0.11L/千克。总清除率是10.52 mL/(minbull;kg)。结果表明，该方法是适于药代动力学研究。

关键词: 银杏叶;黄酮类化合物;槲皮素;山柰酚;异鼠李素;酸水解;正交试验

引言

银杏是一种古老的植物距今已有3亿年[1]。银杏叶提取物已被广泛用于治疗，增加在全世界几十年[2] PE-ripheral和脑血流量以及用于痴呆的治疗。标准的银杏叶提取物，银杏叶提取物761reg;，含有22％-27％，黄酮类化合物和5％-7％的LAC色调。大部分的黄酮类化合物是槲皮素，山萘酚，异鼠李素，通过beta;糖苷键连接到到单 - ，二 - ，或三糖苷。糖苷配基在提取物中的含量小于0.1％[3]。

最近，银杏叶提取物的应用已变得更加广泛，并发现与一些制药用品如抗血小板药物，抗抑郁药，利尿药，和非类固醇合成抗炎药[4-6]相互作用。研究表明，银杏叶提取物能抑制人体细胞色素P450。该萜类分数只抑制CYP2C9，但银杏叶提取物的flavonoidic部分表现出较高的抑制CYP2C9，CYP1A2，CYP2E1，和CYP3A4[7-9],为了消费者的安全，在体内的黄酮类化合物的动力学行为，它变得越来越重要。一些草药产品的药代动力学已经[ 3,10,11 ]报道。然而，在整个复杂的药代动力学在有限的范围内，只有几个化合物的配合物被确定为复杂的动力学行为。实验希望能够反映了整个血浆中的复合物，例如，总黄酮。

在植物中，大多数类黄酮在糖苷的形式存在，因为糖基化增加了黄酮的在水中的溶解度，细胞的液泡的存储对他们是必要的[12]。甙认为不可能直接由口腔系统吸收，然而，它们可以被转化为视锥细胞促进肠道内细菌的吸收。然而，其他研究显示，黄酮类化合物不仅完整地吸收的钠，依赖性葡萄糖转运蛋白（SGLT-1）也存在苷和血浆中的代谢物[ 18 ]。临床研究发现，非常小的不变的苷元的血浆，它们的共轭代谢物的浓度是相当高的，尤其是葡萄糖醛酸结合物。类黄酮结合物的活动是非常重要的[21]。黄酮类化合物的代谢物是非常复杂的[22,23]，在血浆中通过HPLC-无线电计数和串联质谱[24]研究最多的槲皮素糖苷，检测18种不同的代谢物。还有一个缺乏对共轭活动的文献确切信息，未知太保-吸住可能通过监测表示单剂量研究[11]血浆浓度 - 时间动力学的所有分析物进行评估。

即使在植物中，由于缺乏参照化合物，并非所有的银杏黄酮可被发现[25]。在1992年，银杏叶提取物的质量控制提供了包括类黄酮接着将得到的糖苷配基的定量色谱测定水解的质量的方法。水解后，将类黄酮化合物变换为槲皮素，山奈酚，异鼠李素。糖苷配基很容易通过反相高效液相色谱法确定。黄酮的含量则等于苷元乘以各自的系数[26,27]的浓度的总和。该方法也可以与用于生物样品，例如，等离子体。经过水解，各种黄酮和甙元，其代谢物和偶联物很可能是形成为反式的三元槲皮素，山奈酚，异鼠李素。所有反映血浆中的药代动力学参数的这些复杂的化合物统称为总黄酮。

这一假说通过检测槲皮素、山奈酚的方法验证和酸水解后异鼠李素被用于同时测定总黄酮。之后，该方法被用来研究大鼠总黄酮的药代动力学的影响。

1 材料与方法

1.1试剂和化学品

槲皮素的参考标准（Q），山柰酚（K）和异鼠李素（I）是从国家研究所中国药品生物制品（中国，北京）购买。银杏叶提取物（EGB）从我们的实验室获得批号050418，含35.99％，黄酮类化合物（从糖苷配基含量计算）。乙腈和甲醇（色谱级）购自J.T.购贝克（美国）。泊洛沙姆从巴斯夫股份公司，路德维希港（德国）购买的。氨水，磷酸，盐酸，和磷酸二氢钠（分析纯）的二水合物购自北京试剂（中国）获得的。蒸馏水用于所有的准备工作。

1.2高效液相色谱仪和条件

HPLC系统包括一个515 HPLC泵（Waters, USA），一个的Rheodyne7725I手动喷射器（Waters, USA），一个996光电二极管阵列检测（Waters, USA），以及一个millennium32色谱工作站。分离使用C18色谱柱（5微米，4.6times;150毫米; Waters, USA）护柱（C18;5微米;4times;15毫米;北京分析仪器公司，中国）。流动相为乙腈 - 0.02mol/ L的磷酸二氢钠溶液，含0.2％磷酸，pH值= 2.0，（35:65，V / V），通过0.20微米的微孔过滤器过滤，并在使用之前脱气。流速为1.0ml/min。检测在360nm的柱保持在一个恒定温度波的长度（30℃）。

1.3样品制备

将400micro;L血浆样品，200mu;L的盐酸（10 mol/L）和400mu;L甲醇准确加入到试管中。然后，将试管用盖密封并涡旋30秒。之后将混合物在90℃水解120分钟。然后将管放入冷水中以100mu;L氨（15摩尔/升）加入到混合物中以终止反应。该混合物7毫升用甲醇萃取，涡旋2分钟，超声处理30分钟，然后以3000r在室温下离心20分钟。取4ml上清液在真空下蒸发，在30℃浓缩至干。将残余物溶解在200micro;L甲醇中并涡旋2分钟，并在5000r离心10分钟。最后20mu;L的上清液注入到HPLC系统进行分析。该方法应用在整个实验中除非特别指出。

1.4校正曲线

校准曲线是通过添加槲皮素、山奈酚、异鼠李素标准品建立新的空白血浆，以获得最终浓度75，150，300，600，1200，2400毫微克/毫升为槲皮素，71.25，142.5，285，570， 1140，2280纳克/毫升的山奈酚，和70，140，280，560，1120，2240纳克/毫升的异鼠李素。校准曲线是根据峰面积与每种糖苷配基浓度下的线性回归。

1.5恢复

恢复通过比较标准的糖苷配基 - 掺入血浆中检测到原本的增加量在150，600 2400毫微克/毫升为槲皮素，142.5，570，2280纳克/毫升的浓度确定的量每糖苷配基的量得出为山奈酚和140，560，2240纳克/毫升的异鼠李素。

1.6精密度

槲皮素、山柰素、异鼠李素的日内精密度是通过检测在五次重复在浓度150，600使用加标血浆制剂，2400毫微克/毫升，槲皮素，142.5，570，2280毫微克/毫升为山奈酚，140，560，2240毫微克/毫升异鼠李素。日间精密度均在同一浓度的精度在连续五天交易日。

1.7药代动力学研究

雄性Wistar大鼠（180-220克），来自中国医学科学院（中国，北京）实验动物研究所，在实验中使用前禁食12小时。银杏叶提取物溶于生理盐水（0.5％泊洛沙姆作为增溶）高达10毫克/毫升作为注射剂。对55只大鼠通过股静脉，按50 mg/kg的剂量（18毫克/毫升含黄酮类化合物）注射给药。血是从由肝素化的针头和注射器腹主动脉后收集15，25，30，60，90，120，240，360，480，600，从每次5只大鼠给药720分钟。然后将血液在3000r离心15分钟，获得的血浆样品存放在minus;80℃直至化验血浆样品。

1.8黄酮类化合物配方

总数黄酮类化合物确定为

Cflavonoids=2.51Quercetin 2.64Kaempferol 2.39Isorhamnetin，

CX代表x的浓度。（以总黄酮和苷元之间的比例计算成份指数算）[26,27]。

1.9药代动力学分析

所有的统计分析均使用微软Excel 2003进行，利用软件3P97计算药代动力学参数（实际医药项目1997），由中国药理学会建议。

2结果与讨论

2.1提取优化

正交试验设计优化了等离子体的三苷元的回收率。实验分析了温度，时间，和HCl浓度对水解的影响。由于血浆中的蛋白质和其他组成部分，使用了较高的盐酸浓度（2摩尔/升）。糖苷配基在实验期间保持稳定，水解反应结束时，少量的氨具有提取效率的显著影响。正交试验，采用L9（34）表与固定的盐酸浓度为2 mol/L，包括水解温度3个因素（一）、水解时间（B）、氨浓度（C）3个层次各因素（表1）。在样品制备的三个因素，如表1所示的测试血浆样品，掺有1.20micro;g/mL槲皮素、山奈酚micro;1.14克/毫升，1.12micro;克/毫升异鼠李素。

在表1中显示，而两个槲皮素（92.87％），异鼠李素（93.40％）的最大回收率显示在测试9.表2预货物内的单变量分析山奈酚（92.97％）的最高回收率显示，如用SPSS12.0版进行处理三个苷元的估计的恢复装置。

如表2所示，为槲皮素和山奈酚，氨浓度比水解温度比水解时间更为显著，异鼠李素温度是最重要的影响较大，时间，其次是氨浓度。。虽然有因素（Pgt; 0.05）之间无显着性，这并不意味着该因素对反应的影响少，或者测试样片太小是为测试足够灵敏。从图2中，我们看到，90℃水解120 min和0 mol/L氨水是槲皮素和异鼠李素的最佳条件，而90℃水解120 min，200micro;L 7.4 mol/L的氨是最佳山奈酚。研究结果还表明，7.4 mol/L氨水引起很小的降低对槲皮素和异鼠李素的回收率比无氨，但它明显增加了山奈酚的恢复。因此，确定为90℃水解120 min，200micro;L 7.4 mol/L氨水是所有三苷元的最佳选择。对氨的影响，一个可能的解释是：它改变了从强酸性pH为2-3的酸度，并产生大量的氯化铵，是通过改变蛋白质结构防止苷元提取AGL锥结合良好。然而，过量的氨会变换系统碱化和可能破坏苷元结构。

2.2特异性

黄酮类化合物的色谱图如图3所示。黄酮水解前和水解后的色谱图（图3b和3c）表明，发酵提取物具有高含量的黄酮苷元，而且黄酮在这些条件下已充分水解。空白血浆的水解（图3d）没有产生任何干扰峰从内源性成分与苷元加标血浆（图3E）。银杏叶提取物的色谱图标（图3F）和银杏叶提取物的管理（图3g）血浆样品为苷元的色度直方图为相似峰。血浆中黄酮类化合物的水解，生成的苷元的检测都是通过这些图谱。

在峰顶的数字标记是槲皮素、山奈酚、保留时间和异鼠李素，分别约为5.3、9.5、10.2 min，流动相组成的乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钠溶液，含0.2%磷酸，pH值为2，（35:65，v/v）通过过滤0.20micro;m微孔过滤和脱气前使用。流速为1毫升/分钟。检测是在波长为360nm波长保持在一个恒定的温度（30℃）的列的波长进行的。

2.3校正曲线的线性度

校准曲线的线性度由峰面积ANALY-SIS评价为糖苷配基掺入空白大鼠血浆。回归方程为血浆标准分别为：y=76.395x 4443.7槲皮素在75-2400纳克的浓度范围/毫升（R2 =0.9996），Y =137.38x 6161.7为山柰酚为71.25-2280毫微克/毫升（R2 =0.9997），并且y =66.626x 1660.7为异鼠李素为70-2240毫微克/毫升（R2 =0.9996）（x是糖苷配基的坯料大鼠血浆中的浓度和y为糖苷配基的峰面积）。

槲皮素检测限（LOD）（信噪比= 3）为20毫微克/毫升，山奈酚为20毫微克/毫升，异鼠李素为50毫微克/毫升，和定量限（LOQ），定义为最小可检测的样品浓度（信噪比＞10）在大鼠血浆足够的分析精度（RSD＜10%）分别为75 ng / mL的槲皮素、山柰酚71.25 ng/ml，70毫微克/毫升为异鼠李素。

2.4回收率和精密度

最低回收率为88.27％plusmn;槲皮素1.08％在2400纳克/毫升的浓度。最高RECOV - 红霉素为106.08％plusmn;1.13％，在140纳克/毫升的concen-tration异鼠李素。回收率分别为槲皮素，山奈酚，异鼠李素的相似浓度相似，如表3所示。

日内试验中的CV分别为3.3％，2.8％，及4.6％和日间测定分别为7.8％，8.6％，和150，600，2400纳克/毫升的血浆槲皮素浓度6.4％。为山奈中-TRA天测定分别为2.4％，2.1％和1.5％，而在叔天测定分别为4.5％，3.8

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