Rhanterium adpressum花提取物的抗菌活性取决于季节性变化

原文作者 Hadjer Boussoussa^a,*, Ihcen Khacheba^a, Amar Djeridane^a, Nabila Mellah^b，Mohamed Yousfi^a

摘要：该研究的主要目的是为了评估溶剂萃取法（丙酮或甲醇）对Rhanterium adpressum花提取物的总酚含量和抗菌电位的影响。植物花卉是从2011和2012这两年不同的三个月（4月、5月、6月）中所收获。有机萃取的总酚含量（TPC）用福林酚法测定；然而其抗菌活性是用纸片扩散法测定。在4月份收集的R.adpressum甲醇提取物检测到的酚含量最高。活性提取物中酚类化合物的浓度与提取物活性的联系在抗菌试验中既明显又显著，且抗菌活性对金黄色葡萄球菌和伤寒沙门氏革兰氏阳性菌更有效。这是第一份报告关于酚类化合物季节性变化和R.adpressum的抗菌活性，而且对于具有抗菌性能的新分子勘探会有有趣的发现。

关键词：抗菌活性；酚类化合物；Rhanterium adpressum

引言

来自菊科的Rhanterium属分布在北非的西部（阿尔及利亚和摩洛哥东部边境地区），阿拉伯半岛，伊拉克和伊朗（Wiklund, 1986）。Rhanterium adpressum在阿尔及利亚俗称为“Arfadj”，因其广泛分布而容易认知且被当地居民作为抗利尿剂来生产奶酪和民间药物。在文献中关于Rhanterium物种的次级代谢产物只有少数的研究（Bouheroumet al., 2007； Kala et al., 2009；Hamia et al., 2013）。从Rhanterium adpressum花和Rhanterium木樨的地上部分中得到的有机萃取物（乙酸乙酯）被证明是抗氧化剂的一个潜在来源（Boussoussa et al., 2014； Bouaziz et al., 2009）。同样地对于已经观察到的抗氧化性能，R. adpressum的抗菌活性也有相关报道。通过从植物的地上部分水蒸气蒸馏提取的精油显示对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和尖孢镰刀菌的抗细菌和抗真菌活性（El-houiti, 2010），而R. adpressum的酚类提取物对蜡状芽孢杆菌和粪肠球菌呈现了良好的活性（Boussoussa et al., 2014）。此外，Rhanterium adpressum中的各种天然化合物被检测出，例如从R. adpressum地上部分的氯仿萃取物得来的beta;-桉叶醇，16b-羟基聚-3-十六烷和豆甾醇（Bouheroum et al., 2007）。并且含氧单萜和倍半萜如斯巴醇和beta;-桉叶醇很大水平是由R. adpressum精油确定（Kala et al., 2009）。这些结果表明，这种植物的潜力就像药材和饮食健康供应。

不同的因素可确定在植物中次生代谢产物的轮廓，物种和物候的基因型特性是决定植物化学轮廓的关键要素（Fillipini et al., 2010）。生物因素（病原体和取食）和非生物因素（光线，温度，营养物质和水的供应），以及地理条件，可能会直接影响植物次生代谢物的化学成分（Moura et al., 2010;Sousa et al., 2009）。酚类化合物包括黄酮类，常常涉及到在防紫外线，化感作用和吸引传粉昆虫时植物与环境的相互作用（Graceand Logan, 2000)。

据我们所知，还没有报道表明Rhanterium adpressum提取物的抗菌作用以及季节和酚类化合物含量之间的关系。研究这一物种对于新的抗氧化剂和抗菌分子前景有用。因此，本研究的目的是确定季节性对使用两个溶剂的提取的R. adpressum花酚类化合物的水平的影响和评估植物提取物的抗菌潜力。

材料与方法

1.植物材料

R. adpressum Coss. amp; Durieu 是通过Pr YOUSFI Mohamed在2011年和2012年三个不同的月份（四月，五月和六月）的Zelfana地区（位于阿尔及尔的东南偏南660千米，北纬32°23rsquo;46”，东经5°13rsquo;34”，海拔354米处）收集，通过Pr CHAHEMA Abedelmajid（阿尔及利亚瓦尔格拉大学生物系）认证。一份凭证标本（RACD47/05/07）放置在艾格瓦特大学基础科学研究实验室标本馆，得到的材料分别在室温下干燥和精细研磨成细粉。

2.提取物

干重（DM）为5克的样品在室温下用无水甲醇和丙酮（24小时times;两次）进行萃取。过滤后，各馏分利用真空蒸发器中蒸发和提取的级分进行称重，以确定总酚含量，然后在 4℃用于进一步分析。

3.总酚含量

根据Singletonand Rossi (1965) 方法，利用分光光度计分析甲醇和丙酮提取物的总酚含量。样品（100升，三次重复）加入含有500微升的福林酚试剂（1/10水溶液）和2毫升碳酸钠（2％）的试管。在管中的内容物混合并静置30分钟。吸光度在765纳米处（岛津1601紫外可见分光光度计）测量。总酚含量由每克植物材料干重的没食子酸当量（GAE）表示。

4.筛选抗微生物活性

R. adpressum酒精提取物抗菌活性的季节性变化对两种革兰氏阳性菌即金黄色葡萄球菌ATCC 25923和伤寒沙门氏菌（分离株），以及两种革兰氏阴性菌即大肠杆菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853的评价（表1）。微生物从(Laboratoire de Microbiologie de lrsquo;Hopital de Djelfa; LMHD)获得。

表1：本研究中所用的微生物来测试Rhanterium adpressum提取物的抗微生物活性

在3毫升MH肉汤中接种每个测试细菌一菌环量在37℃下工作培养12小时。测试中，将过夜肉汤的浊度调节至0.5麦克法兰标准，然后才能为了在活性测定使用它们而将0.9％NaCl溶液稀释至最终106CFU/ mL接种物浓度。

抗微生物实验是按照Cseke et al. (2006）实行的。如前面所述，甲醇和丙酮的粗提取物对四种微生物菌株的抗微生物活性通过琼脂纸片扩散法进行确定。100微升接种物分布在含有无菌Mueller-Hinton琼脂（pH7.2）平板中，二甲亚砜DMSO（10%）稀释的各提取物（10mu;L/disc）灌注的滤纸片置于所述介质（分别是50, 100 and 150mu;g/disc）的表面上。

将板在室温下静置15分钟，以使提取物的扩散，并在37℃下培育18小时。在该期间结束时，测定盘周围的抑制区。

结果与讨论

分别讨论初步实验设置在总酚生产率和相应的抗菌活性，来评估植物及植物部分提取溶剂（丙酮或甲醇）的开花期的效果。总之，12个样品在研究过程中都进行了分析。图1，表示每个样品提取物2溶剂和不同时期收集（4，5，6月）的3溶剂所得到的总酚含量TPC（毫克/克）。

图1：两年不同的时期收集与使用两种溶剂萃取（甲醇和丙酮）对于Rhanterium adpressum花总酚产量的影响

样品中总酚的量会有变化，从5.55plusmn;0177至22.8plusmn;0.53毫克/克为甲醇提取物和从8.76plusmn;0.33至14.2plusmn;0.25毫克/克为丙酮提取物（表2）。四月（2011和2012）收集的甲醇提取物含有总酚含量最高。另一方面，丙酮提取物的总酚含量水平低。

表2：Rhanterium adpressum花丙酮和甲醇提取物中酚类化合物的总量

使用两种不同的溶剂对酚类化合物的提取效率有一定影响。虽然具体观察到的，会影响产量的变化（图1）的植物即植物部分（花）收集时期和提取的方法是优化的重要因素。本次调查中，相比于其它菊科植物R. adpressum是花酚类物质的良好来源的结果更为显著（Ben Sassi et al.,2008；Falleh et al., 2008）。它也可以推断，得到酚类化合物的最好的收集时期是四月。

抗菌活性

从一个月到另一个月的抑制区的差异和取决于浓度的所有提取物中观察到对两种试验的革兰氏阳性菌的抗菌活性（图2）。然而，针对在某些时期不同大肠杆菌和绿脓杆菌有一个完整的衰减伴随的活性变化。在四月至六月期间收集到的提取物中检测到了最高的抑制活性，（图2）。表3和4体现了通过用测试微生物作为标准的甲醇和丙酮的提取物和没食子酸来施加抑制区的直径。从纸片扩散法得到的结果表明，伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌是最敏感的微生物，其显示四月份是最大的抑制区（春季）。这个结果可以通过革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细菌细胞壁的结构的差异来解释。除了细胞膜，革兰氏阴性细菌具有一个由磷脂，蛋白和脂多糖组成的附加外层膜，而且该膜是不能透过大多数分子（Carlos Silva et al., 2012）。

图2：Rhanterium adpressum花酚类提取物的抗菌活性

表3：Rhanterium adpressum花提取物和片段对微生物的抑制作用

表4：测试标准没食子酸的抗菌活性

对于季节改变，在所研究的R. adpressum酒精提取物的抗菌活性的变化可能是由于活性间接产物的数量或者品质的变化。许多研究已经注意到与物理（温度和光照）和生物因素相关联，例如生命周期和食草动物的压力，陆生植物的化学防御分子变化很大（Popov et al., 1985）。

虽然是根据所使用的溶剂（丙酮，甲醇）观察到的差异和微生物测试，但是R. adpressum的提取物显示出抗微生物活性。

需要通过生物测定引导的分级分离和它们的表征以及研究评价其安全性进一步的调查，得到特定的生物活性化合物的分离。

致谢

我们非常感谢收集植物的YOUSFI Mohamed教授(Laboratoire des sciences fondamentales, Laghouat University) 和鉴定物种的CHAHEMA Abedelmajid教授。我们还要感谢生物学系提供必需的设施。

参考文献

Ben Sassi, A., Harzallah-Skhiri, F., Bourgougnon, N., Aouni, M., 2008. Antimicrobial activities of four Tunisian Chrysanthemum species. Indian J. Med. Res. 127,183–192.

Bouaziz, M., Dhouib, A., Loukil, S., Boukhris, M., Sayadi, S., 2009. Polyphenols content antioxidant and antimicrobial activities of extracts of some wild plants collected from the south of Tunisia. Afr. J. Biotechnol. 8 (24), 7017–7110.

Bouheroum, M., Benayache, S., Benayache, F., Zaiter, L., Barrera, J.M., Francisco, L.,2007. Terpenoids and triynepoxide from the aerial part of Rhantherium adpressum. Chem. Nat. Compd. 43, 110–111.

Boussoussa, H., Hamia, C., Djeridande, A., Boudjeniba, M., Yousfi, M., 2014. Effect of different solvent polarity on extraction of phenolic compounds from algerian Rhanterium adpressum flowers and their antimicrobial and antioxidant activities. Curr. Chem. Biol. 8, 1–7.

Carlos Silva, J., Rodrigues, S., Feaacute;s, X., Estevinho, L.M., 2012. Antimicrobial activity,phenolic profile and role in the inflammation of propolis. Food Chem. Toxicol.50, 1790–1795.

Cseke, L.J., Kirakosyan, A., Kaufman, P.B., Warber, S.L., Duke, J.A., Brielman, H.L.,2006. Natural Products from Plants, 2 ed. Taylor and Francis Group.

Elhouti, F., 2010. Composition chimique, activiteacute;s antimicrobienne et antioxydante des huiles essentiel

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