工业作物和产品

高良姜的精油提取物的化学成分和抗菌活性对食源性致病菌有选择性抑制作用。

摘要：

关于食品加工和贮存过程中使用合成的防腐剂的关注度已因其对人类健康和环境的具有潜在的副作用而提高。它的化学组成、杀菌活性和对从水果，叶片和茎中用水蒸馏的提取的高良姜精油提取物的机制分别首次作为合成防腐剂的潜在替代品。食品加工和贮存过程中使用合成的防腐剂对四个食源性致病菌3 EOS（金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，绿脓杆菌）的抑制区（DIZ），最小抑制浓度（MIC）和最小杀菌浓度的直径（MBC）显示了它们的广谱性强抗菌活性。值得注意的是，3EOS对金黄色葡萄球菌有明显的影响，叶片精油（16.8毫米）的DIZ对金黄色葡萄球菌的抑制作用接近抗生素链霉素（18.3毫摩尔）。从链霉素扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察的基础上来看，高良姜EOS的抗菌机理是不同的。 高良姜 EOS可能会增加细菌细胞膜的通透性和直接使细胞结构破坏，导致细菌收缩和裂解。对人血红细胞（RBC）三种EOS低溶血率（低于1％），还建议其使用的安全性。两者合计，高良姜精油可提供在食品加工和贮存过程中的自然安全的防腐剂。

引言：

食品在加工和贮藏过程中由于微生物造成的腐败变质可能导致经济损失，甚至是食物中毒和食源性疾病（Shan等人，2007; Runyoro等人，2010）。由于对环境和人类健康存在潜在的副作用，合成化学防腐剂的使用已引发消费者的担忧（Singh等，2008;奥兹坎和Chalchat，2009）。频繁使用上瘾的苯甲酸钠可能会造成蓄积毒性，并诱发哮喘（弗里德曼，1977;奈尔，2001）。此外，一些化学物质，如硝酸盐和亚硝酸盐甚至可能进入食材转换成毒素（斯托伊科等人，2011年）。因此，对于新的和更安全的具有强杀微生物能力的抗微生物剂的搜索是非常关键的（Cakir的等人，2005; Goni的等，2009）。近几年，天然精油很可能成为食品产业中更为安全的防腐剂，因为这一特性，很多科学家对其产生科研兴趣。

从芳族植物次生代谢物得到的精油是有强烈气味特征的挥发性和复杂的化合物（Bakkali等人，2008）。它们中的一些已经被证实具有很强的抗菌性能（哈吉等，2010）。此外，已经证实，精油可以瞄准冷血昆虫很少损害温血动物，应用在食品产业中可以增强其安全性以及消费者的接受度。

属姜是姜科最大的属，有230种，分布于亚洲，有51种在中国（福等，1999;雷纳等人，2014年）。已报道一些种类的属高良姜具有抗微生物活性，在食品中广泛使用甚至是在药物中。（Sharma和Hashinaga，2004; Sun等人，2013; Klancnik等人，2014年）。例如，高良姜在亚洲是一种流行的香料和风味，还发现应用在许多饮料中。（Yang等，2009; Singh等人，2011）。另外，从属良姜中提取的丰富精油已被报道具有各种生物活性，如杀幼虫和抗氧化性能（皮诺等人，2014b）。

桂林山姜，多年生草本植物从属于姜属，在中国是广西特有的，易于大规模种植（中国植物志编辑委员会，1997）。它已被用作食品同花椒一起调味。用来摆脱鱼类和肉类的异味（张，2012年）。然而，在这篇文章中，我们的目的是探讨其作为食品防腐剂的潜在可能性。在这项研究中，桂林山姜的茎，果实和叶子的精油都是分别通过水蒸气获得。这三种精油都对四种食源性致病菌（金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌）表现出强大的抗菌活性。而我们发现桂林山姜的抗菌机理通过增加膜通透性，并直接破细胞结构是从通过抑制蛋白质合成的链霉素的不同茎精油。

此外，三个EOS溶血测定对人血红细胞（RBC）和低溶血率的使用安全性进行了（1％以下）进一步证明。

2.材料和方法

2.1简称

GC=气相色谱仪，MS =质谱，FID=火焰离子化检测器，RBC=红细胞，DIZ=抑菌圈，MIC=最低抑菌浓度的直径，MBC=最低杀菌浓度，DMSO=二甲基亚砜，SEM=扫描电子显微镜，TEM=透射电子显微镜，OD =光密度，MHA= M-H培养基，MHB=M-H肉汤。

2.2.植物材料和菌株

桂林山姜的果实，叶子和茎是从龙洞，天河区，广州，中国P.R.收集的。郑高博士鉴定此样本是桂林山姜并且标本凭证沉积于中国南方植物园，中国科学院，广东省P.R.中国的标本馆。桂林山姜精油的抗菌活性分别对四种致病性菌株包括两种革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌ATCC29213和枯草芽孢杆菌CMCC63501）和两个革兰氏阴性菌（铜绿假单胞菌ACTT27853

和大肠杆菌CMCC44825）有抗性。本品系由广州工业微生物和文化的检测中心提供，培养在37℃的MHA或MHB中。

2.3.精油提取

将新鲜的桂林山姜的果，叶和茎样品用水电蒸馏后用克莱文杰装置4小时（郑州中天实验仪器有限公司，中国）。果实，叶和茎会分别产生约0.04％，0.06％和0.03％（以干质量）的令人愉快的淡黄色精油。将得到的精油用无水硫酸钠干燥，并在进行分析和生物测定之前保存在4℃的环境下。

2.4.GC-FID分析

使用Thermo Scientific的装有DB-5柱一焦点的GC仪器（30米times;0.25毫米 直径0.25米）和火焰离子化检测器分析对该精油进行分析。使用氮气作为载气的恒流1.0毫升/分钟的分流比是1/50。烤箱温度从50◦C(保持4分钟)到250◦C(保持10分钟)5◦C /分钟的速度。注入器和检测器温度分别保持在270 C和270?◦C。半定量数据是从不使用的校正因子的FID面积百分比（见补充图。S1-S3）中获得。在相同程序升温条件下各化合物的保留指数和正烯烃（C7◦C30）（参见补充图S4）在同一列中计算。

2.5.GC-MS分析

精油在配备有DB-5MS柱（膜厚为0.25mu;m?30米times;与0.25 mm内径）的岛津GC-MS仪（GCMS-QP2010）里分析，和TEM-023编程和注射器温度对于GC提及。传输线温度是250◦C,氦气作为航母气体的流量1.69 ml / min,分流比等于1/50。离子源温度200 C?EI模式和熔体质量范围m / z 30 - 600。识别个体的化合物是由比较的质谱质谱与企业内部参考图书馆(NIST08)或真实的化合物和证实了比较与真实的化合物的保留指数(亚当斯,2007)在文献中报道(补充图S5)

2.6.抗菌活性的评价

2.6.1.抑菌圈直径的测定

抑制区测定对四所选菌株根据阀瓣扩散法CLSI推荐的(2012)。培养一晚后的细菌悬液由MHB调整到108 cfu /毫升,100 L悬挂在尼古拉斯固体传播媒体的盘子。将滤纸光盘(6毫米indiameter)单独浸满10 L必不可少的油砂后放在盘子培养。板块在孵化37◦C 24 h后用DIZ卡尺的测量值

毫米，链霉素(10 g /盘)作为阳性对照。所有的实验都做三组平行实验。

2.6.2。最低抑制浓度和最小杀菌浓度测定

中等收入国家的山良姜精油测定以micro-well稀释法(Haddouchi et al .,2013),推荐的全国委员会对临床实验室标准(NCCLS)。简言之，在A96孔板中两倍稀释中进行，以获得与浓度范围从0.02至10毫克/毫升，和二甲基亚砜在每孔中2％的最终浓度的精油的稀释液用于溶解精油。加入过夜肉汤培养被测菌株的接种物，得到每孔5times;105 CFU /毫升的最终浓度。所有测试样品准备在穆勒辛顿汤中，和含二甲基亚砜（2％）而无精油阴性对照进行分析为好。将MIC定义为最低的精油浓度细菌在37◦C孵化24 h后并没有表现出明显的增长。微生物的生长是由浊度表示。所有的都做三组平行试验。

2.7.透射电镜观察

2.7.1.扫描型电子显微镜观察

为了确定高良姜茎精油的功效和测试细菌的形态变化，根据以前使用的方法对大肠杆菌进行SEM观察（刁等人，2014）。将在MHB中37◦C下培养一晚后的细菌悬浮液分成两部分。一部分添加精油来自于高良姜给予的最终浓度1.5times;MIC。其他部分被留下的是未处理的对照培养物。这两种悬浮液都在37◦C下培养4小时，然后离心收集细胞。接着，这两种细胞在0.1M PBS（pH 7.4）中，用0.1M PBS在4◦C中固定，用2.5％（体积/体积）戊二醛过夜洗涤两次。下一步，将细胞用30％，50％，70％，90％和100％的乙醇依次脱水，乙醇可用叔丁醇代替。然后使用冷冻干燥设备（JFO-320，JEOL公司，日本）将细胞冷冻干燥4小时，以及通过阴极喷镀将样品金覆盖。最后，在15千伏的加速电压的操作下用扫描电子显微镜（JSM-6330F，JEOL公司，日本）观察到的检测细菌细胞的形态。

2.7.2.透射型电子显微镜观察

大肠杆菌在MHB中，37◦C下培养一夜，随后加入茎精油得到1.5times;MIC的终浓度。然后两种处理过的细菌和对照在37◦C下培养4小时。细胞悬浮液通过离心收获，将细胞在0.1M PBS中，用0.1M PBS（pH7.2的）洗涤两次，并在4◦C下在4％（体积/体积）戊二醛和3％（体积/体积）低聚甲醛中过夜。细胞悬浮液经过离心获取后，用0.1MPBS缓冲液洗涤两次，再用4%(v / v)戊二醛- 3%(v / v)多聚甲醛在4◦C下在0.1MPBS中浸一夜。之后,这些细胞被后缀为2%(w / v) OsO4 在0.1M PBS和冲次缓冲区中2h。下一个样本先后用30%、50%、70%、90%和100%乙醇脱水。细菌用醋酸双氧铀沾染40分钟及柠檬酸铅15分钟与透射电子显微镜在120千伏观察和拍摄(jem - 1400,日本)。

2.8 溶血试验

试验测定溶血性能的三个精油进行人类红细胞。简而言之，精油和参考系列稀释药物添加到200毫升的4%红细胞悬浮液,然后混合在37◦孵化C 1 h。悬浮液在1000times;g离心10分钟,和100毫升上层清液被转移到一个96孔板。光密度测量在540 nm使用标(BIO-RAD 680年,日本)。溶血是通过以下公式计算:

Hemolysis (%) = (OD.S minus; OD.C) (OD.Pminus;OD.C) times; 100

公式中的OD和ODS是削减的光学密度测试样本,分别负控制和积极控制。l控制是PBS的红细胞悬液和积极控制Triton x - 100 1%。一式三份的测试和数据表示为平均值和标准偏差。

2.9 统计分析

抗菌检测都进行了一式三份。阀瓣扩散方法的数据表示为plusmn;SD方法。单向方差分析和邓肯的多个范围进行测试来确定显著差异(p lt; 0.05),男女之间通过统计产品与服务解决方案(SPSS,ver-sion 19.0)。

3 结果与讨论

3.1 精油的化学成分

从表1中给出高良姜的果实，叶子和茎的化学成分看出来自水果、叶子和茎的精油的产量分别为0.04%,0.06%和0.03%。在图1的gc - ms分析的基础上，24部分完全得被确定在这种植物的三个部位中提取的精油。完全，24部件在从该植物萃取三次精油被确定，在图GC-MS分析的基础上的。在水果精油，14玉米磅被确定（总挥发油99.65％），其中主要成分为alpha;-水芹烯（26.74％）和1,8-桉树脑（25.85％），其次是beta;-蒎烯（15.77％），肉桂酸甲酯（10.48％）和beta;-蒎烯（10.27％）。15化合物在叶精油（占总油99.86％），和beta;-蒎烯（49.75％），alpha;-蒎烯（20.16％）和beta;水芹烯（19.94％）为themajor组分进行鉴定。在茎精油，18成分进行鉴定，占石油总的93.35％。占主导地位的成分为alpha;-蒎烯（34.22％）和beta;水芹烯（27.03％），其次是beta;-蒎烯（13.46％）。

3.2 抗菌活性

由纸片扩散法测定高良姜精油的尺寸示于表2中。从三个器官获得的精油对表现出与9.5-16.8毫米DIZ VAL-使用所有测试致病性菌株的抗菌活性。值得注意的是，发现了对金黄色葡萄球菌的最高的抗菌活性，与叶的最大DIZ精油（16.8 MM），其次是茎精油（15.2 MM），相当于18.3毫米抗生素链霉素（10毫克/片）。并观察对枯草芽孢杆菌，E适度杀菌活性。大肠杆菌和绿脓杆菌具有9.5毫米14毫米大小。

MIC和通过微井稀释测定法测定得到的精油的MBC被示为表3所有三种埃森-TiAl基油显示出对四名食源性致病菌广谱抗菌活性。与阴性对照（2％的DMSO）对测试的任何微生物没有抗菌作用。对各种精油的敏感性分别为BAC-特里亚类型相关。三种精油的MIC分别为1.25-10毫克/毫升的INA范围，其中的MBC在5〜10多毫克/毫升。在这篇文章中，最强的活动水果油测试针对选定的细菌，1.25毫克的MIC/毫升（金黄色葡萄球菌，枯草杆菌和大肠杆菌）至2.5毫克/毫升（P绿脓杆菌）和2.5的MBC毫克/毫升（金黄色葡萄球菌，枯草杆菌和E大肠杆菌）和5毫克/毫升（绿脓杆菌）。最高MIC值（10毫克/毫升）和MBC值（gt; 10毫克/毫升）是在叶中发现精油朝测试细菌。然而，叶子的精油有在2.5毫克/5毫克

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