意大利南部葡萄和草莓发生的杀菌剂抗性

种群Botryotinia fuckeliana(葡萄孢属灰质)

原文作者 Rita Milvia De Miccolis Angelini, Caterina Rotolo,Mario Masiello,Donato Gerin, Stefania Pollastrolowast; and Francesco Faretra

摘要
背景: 在意大利南部 Botryotiniafuckeliana(葡萄孢菌)是一个高风险的发展的病菌并产生杀菌剂抗性，杀菌剂抗性监测在2008 - 2011 b . fuckeliana鲜食葡萄葡萄园和种群温室养殖草莓。
结果:分离表现出不同程度的抗anilinopyrimidines(APs)被发现在高频率(高达98%),治疗领域集中在 APs(4 – 7﹣1)喷雾季节。咯菌腈略有降低灵敏度,总是通过AP抗性,通常被发现在较低的频率。葡萄藤中环酰菌胺重复使用(3 - 8喷雾季节minus;1)，导致一个强大的选择高度耐药的隔离(高达100%)。啶酰菌胺抗突变体检测变量，频率(0 - 73%)。外发生抵抗醌抑制剂(QoIs)也确定。多种杀菌剂抗2 - 6不同的行动模式经常被恢复。单核苷酸多态性(SNPs)圆盾基因Erg27 SdhB和cytb环酰菌胺抗性,分别啶酰菌胺和类杀菌剂。
结论: 在意大利南部，在葡萄和草莓上抗常用杀菌剂对灰霉菌是很常见的。这是一个错误的结果使用杀真菌剂,经常因为可检测的最大数量残留的植物保护产品由大型国际零售商和阻抗性突显了至关重要的作用在综合病虫害控制策略。
c 2013化工行业协会
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关键词: 苯氨基嘧啶类;phenylpyrroles; 羟基苯胺类 SDHI杀菌剂;QoI杀菌剂;灰色的模具。

1介绍
灰霉病菌(对于)Whetzel(鉴定葡萄孢属真菌灰质珀耳斯)是一个无处不在的真菌导致灰色的模具疾病在很多经济上重要的农作物,在字段以及在温室和收获后。尽管几间接方法,涉及农业、遗传和生物方法,提出了限制造成的产量损失的灰色模具[1 – 4]疾病管理仍主要基于化学控制。

伟大的适应性不良环境条件由于广泛的遗传变异性，灰葡萄孢霉就是真菌是获得性耐药被认为是高风险杀菌剂吗(杀菌剂抵抗行动委员会:http:// http://)。

自1960年代末以来,在b . 灰葡萄孢霉杀菌剂抵抗已经成为一个主要的问题在农作物保护由于介绍的杀真菌剂单模式的行动,获得性耐药被经验丰富的世界。

苯并咪唑和二甲酰亚胺的集约使用杀真菌剂导致耐药菌株的快速选择不同的国家,在[5-7]在温室里[8 – 11]抵制最近介绍了杀菌剂,如苯氨基嘧啶类phenylpyrroles羟基苯胺类,也被报道。[12 -19]此外,田间抗性的小说琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)fungicideswas检测不久他们的介绍。　　-隔离抵抗醌抑制剂(QoIs)外,有一个广泛的活动应用对灰霉病几种作物以外的疾病, 已发现在b . fuckeliana田间种群。[20-22] 耐药性的发生和蔓延造成减少灰

隔离的b fuckeliana

显示多个抗性两个或更多的杀真菌剂与不同的行动模式[7][10][29-33]

分子描述b fuckeliana隔离或敏感对单杀真菌剂,包括遗传分析减数分裂进行显示,参与基因的效应真菌和强抗性表型之间的联系和pointmutations -单核苷酸多态性(snp)。[34]这已经证明了好几组杀真菌剂,包括苯并咪唑[7][8] [35-38] 二甲酰亚胺[35][39-41] 抑菌灵[42]SDHIs[26][43-46] 羟基苯胺类[18] QoIs。[25][28][47]。

因为过去的经验在B杀菌剂抵抗。fuckeliana,如今它监控的发展是至关重要的电阻在为了评估特定作物的风险和生长条件,适当阻抗性计划策略。摘要杀菌剂的处理结果抗性监测项目表——贸易领域都有葡萄葡萄园和温室养殖草莓,在意大利南部,提交到密集的杀菌剂喷雾时间表灰色的模具。

2材料和方法
2.1监测杀菌剂的耐药性

监测意大利南部杀菌剂的耐药性的反应b fuckeliana不同类型的种群杀真菌剂对病原体的有效监控2008 - 2011年在商业鲜食葡萄葡萄园和草莓温室。
更具体地说,监测进行了36个表-阿普利亚地区的葡萄葡萄园,选择因为低喷雾时间表对灰霉菌的有效性注意到。像往常一样在不断增长的地区,大部分的葡萄园种植葡萄的履历。意大利种植凉亭训练系统(“tendone”)覆盖塑料薄膜推迟收获到12月,因此提交中大量使用杀真菌剂对灰色的模具。观察也延长未经处理的葡萄园用作控制:三个2008年(cvv。黑色的珍珠、黑魔法和唐Mariano)2010年(简历。Regina)。在2010年12葡萄园的监控,灰色的模具症状是评估在所有串四个采样时间块十葡萄。植株进行单独培养腐烂记录根据实证和八类的规模吗严重程度(0 =没有感染,7 =腐烂扩展 超过75%的浆果)。Datawere用来估计患病率感染的比例(P),即束,和疾病的严重程度,测量McKinney指数(MKI)。[48]

草莓的监测进行了在2009 和2011,25温室位于Metaponto地区最大的之一草莓养殖在意大利南部地区。植物的简历。Candonga,Ventana,Naid Pyr 5种植和有不同的杀菌剂喷雾的历史。样品收集b . fuckeliana的分生孢子,通过使用captaspores,[49]至少30自然感染的葡萄束或草莓每一个监控。抽样进行在收获时间,从10月到12月的小道消息并为草莓从一月底到5月。

从每个样本,分生孢子的悬架包含10的6次方分生孢子毫升minus;1制备蒸馏水渐变为0.01 和用于接种适当的媒体,也许或修改,经过高压灭菌法,单杀真菌剂浓度之间的歧视和野生型敏感耐药表型。

2.2杀真菌剂
技术等级苯菌灵[苯并咪唑(BZ);杜邦de穆尔和有限公司,威明顿,德],

vinclozolin[a dicarboximide(直流);BASF、Limburgerhof、德国),pyrimethanil[一个anilinopyrimidine(美联社);BASF AG)],fludioxonil[phenylpyrrole(PP);先正达,Muml;unchwilen,瑞士]和trifloxystrobin[QoI;BASF AG)溶解在二甲亚砜。商业配方的boscalid[SDHI旋律,50%的活性成分(AI);BASFAG]和fenhexamid[Teldor,第三类甾醇生物合成ai抑制剂(SBI-III),50%;BayerCropScience,德国勒沃库森,)
在无菌蒸馏水被停职。最终的浓度的溶剂是相同的所有媒体,包括控制,和从未超过10毫升升minus;1。

2.3培养基
所有的成分是每公升的水,和所有的培养基包含20 g Lminus;1琼脂Oxoid 3号。葡萄糖琼脂(GA:10 g葡萄糖)作为培养基来评估对热的敏感性和DCs。葡萄糖琼脂钾(GKA:10 g的葡萄糖,2 gK2HPO4 2 gofkh2po4)被用来评估的响应SBI-IIIs。基本培养基[MM:10毫升的解决方案(KH2PO4 10克,100毫升的水),10毫升的解决方案B(gof NaNO3 20克,5氯化钾、5克MgSO4·7水,0.1 g的摘要,100毫升的水),1毫升微量营养素解决方案,50 20克葡萄糖)是用于APs。醋酸基本培养基(AcMM:毫米没有葡萄糖,5 g醋酸钠,柠檬酸的0.01米,调整pH值6.0用于SDHIs KOH)。麦芽提取琼脂(MEA:20 g的麦芽提取Oxoid)是用于验证对PPs的敏感性的变化。量(MEA的2 Mm 的异羟肟酸的特定抑制剂抗氰呼吸替代呼吸)用于QoIs。

2.4杀菌剂响应分析
已知参考b fuckeliana菌株的敏感性或抗杀菌剂被用作控制在每一个测试
GA中修改与苯菌灵(10毫克Lminus;1)或乙烯菌核利(5毫克Lminus;1) 被用来评估敏感 BZs and DCs分别由分生孢子的萌发试验。
8 o百分比分生孢子显示正常生殖杀菌剂媒体在21 ~ 24 h(孵化后plusmn;1◦C是评估通过在显微镜下观察(times;200放大)三种随机抽样100分生孢子。在所有情况下,频率o耐药分生孢子计算考虑频率o分生孢子的萌发fungicide-unamended控制媒体。

应对SBI-IIIs,一系列的三个小数稀释o每个分生孢子的悬架(10的6次方分生孢子毫升minus;1)在100年被镀mm 灭菌盘包含GKA修改两个环酰菌胺的缩聚物来区分的分生孢子中度(0.4毫克Lminus;1)或高(4毫克Lminus;1)阻力位。51殖民地的发展在4 - 7天内孵化项目21plusmn;1◦C中被修改培养基为了确定耐药表型的频率。

MM和嘧霉胺也许或修改(1球型minus;1)[52]与啶酰菌胺AcMM修改(10毫克Lminus;1)[44]是用来发现分别和量化分生孢子对APs和SDHIs分生孢子萌发和/或殖民地增长测试,不同在预期的抗真菌浓度个体意味着修改咯菌腈(0.3毫克/Lminus;1)[53] 是用于验证对PPs的变化反应,而应对QoI杀菌剂在多边环境评估的肟菌酯(1毫克/Lminus;1)。[28]

多个抗性在b . fuckeliana种群的传播评估,确定电阻不同的配置文件231年和431的杀菌剂单分生孢子的隔离从葡萄藤和草莓,分别来自单一的对至少一个测试的杀菌剂。获得单分生孢子的隔离, 分生孢子在低密度水传播使用解剖琼脂和萌发后单独收集显微镜。隔离单独测试他们的反应每一个七杀真菌剂测试。菌丝的插头的积极的利润增长殖民地被翻了个底朝天fungicide-amended或也许媒体。歧视浓度是如上所述。◦孵化后21plusmn;1℃黑暗中2 - 4天,隔离种群增长认为是耐药,而隔离的增长抑制被认为是敏感的杀菌剂进行测试。

2.5表型特性描述
抗性是通过群体增长测试评估大约十抗性分离,选为代表的不同杀菌剂的抗性表型,为每个类。Trireplicated菜(100毫米直径)包含适当的介质,也许浓度增加或修改7 - 9杀菌剂(0.01 - -0.1 to100mglminus;1), 与菌丝体接种插头(4毫米)积极发展文化。抑制效应通过测量两个正交杀菌剂的决心开发的菌落直径2 - 8天后孵化21plusmn;1◦在黑暗中C。的最低抑制浓度(麦克风)的最低浓度抑制菌落生长。EC50(殖民地的有效浓度抑制50%增长)决定使用剂量反应曲线。这两个参数4天后计算获得的数据对于大多数杀菌剂,除了boscalid(7天)。阻力系数(RF)计算之间的比率的EC50值耐药野生型隔离隔离和均值EC50值。

2.6遗传特性描述

SBI-IIIs SNPs 是寻找采取特定关键基因的阻力,在b . fuckeliana SDHIs 和QoIs。从菌丝体中提取的DNA,如前所述。[44]裂解放大多态序列(帽)与限制性内切酶分析AluI(sigma;-奥尔德里奇、米兰、意大利)是用于检测G143A突变29个分离株耐肟菌酯基因。[28] ADNA所涉及的基因扩增片段菌进行基因序列分析在抵抗环酰菌胺、啶酰菌胺。15日进行隔离环酰菌胺和显示不同程度的阻力31 boscalid-resistant隔离。[18][44]

在50mu;L进行PCR扩增反应混合物包含0.1 - -0.3mu;g DNA模板,MgCl2 1.5毫米,0.2、0.1毫米每个核苷酸,mu;M每个引物,和2 U的豆类LA Taq(豆类生物公司,大津,志贺,日本)。引物用于分析抗啶酰菌胺 b . fuckeliana放大隔离SdhB区域包括基因突变有关阻力。[44]至于环酰菌胺,两个特定引物对是为了放大部分重叠的碎片。b . fuckeliana Erg27基因(基因银行加入编号 AY220532)为了探索整个序列的基因。序列引物和DNA扩增片段大小的报道在表格1中。

循环放大进行了TM热循环(Bio-Rad实验室、大力神、CA)设定为5分钟,95℃◦紧随其后的是30 1分钟95℃的周期在60℃,1分钟在72℃,最后7分钟72℃延伸。 PCR产品,后进行净化与量子预科PCR克林SpinColumns(Bio -Rad实验室),在向前和直接测序相反的方向,使用相同的引物PCR,由外部服务(Macrogen欧洲单一EZ-seq直接DNA测序服务,阿姆斯特丹,荷兰)。DNA序列分析使用SeqBuilder Lasergene和SeqMan Pro软件包(v.10.1;DNASTAR公司,麦迪逊,WI)。

3 结果

3.1监测杀菌剂的耐药性

化学防治的鲜食葡萄葡萄园,灰色的模具主要是基于嘧霉胺(Scala,巴斯夫意大利米兰,意大利),混合嘧霉胺 咯菌腈(开关,先正达农作物保护),

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