表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对体内和体外老年色素形成的抑制作用

原文作者 Shuxian Cai ¹ , Jianan Huang ¹ , Li-li Wang ¹ , Xin-rong Dong ¹ , Yu-shun Gong ¹ , Juan Li ¹ , Qing Li ¹ ,Zhong-hua Liu ^{1,2 *} and Guo-an Luo ²

¹国家工程技术研究中心利用植物中的功能成分和茶科学教育部重点实验室，湖南农业大学，长沙 410128，中华人民共和国

²化学系，清华大学生物有机重点实验室，教育部磷与化学生物学，北京 100084，中华人民共和国

摘要:脂褐素老年色素常被认为是老化的标志，它的积累率与寿命成反比，是羰基交联蛋白残留物的主要组成，本研究的目的是用荧光分光光度法、反相高效液相色谱法、红外光谱仪法和扫描电镜与透射电镜法，确定表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是否抑制老年色素在丙二醛修饰人血清白蛋白和D-半乳糖衰老小鼠模型中的形成。结果表示,表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）会抑制老年色素在体内和体外的形成。构效关系表明，这种抑制作用除了与抗氧化应激和俘获反应性不饱和醛有关，还受到儿茶素的没食子酰基环的中和氨基羰基交联反应影响。

关键词：表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、老年色素、没食子酰基、氨基羰基交联产物

简介

脂褐素也叫作老年色素，是一种在溶酶体有丝分裂后细胞中逐步积累的棕黄色、电子致密的自动荧光材料，比如在神经元和在心肌细胞中（Peyroux and Sternberg, 2006）。脂褐素是羰基交联蛋白残留物和的主要组成，主要来自晚期脂质过氧化产物(ALEs)和晚期糖基化终末产物(AGEs) 的“羰基应激”。由于它们的低能量的潜在结构羰基化合物难以清除，比如环化和/或共轭（Yin, 1995)。结果，羰基化合物稳定和不可逆的交联被认为是体内常见的和重要的产毒过程，可能是疾病和老化相关的功能损失的根源（Berlett and Stadtman, 1997; Suc et al., 1998）。

上述出版物表明最好的抑制老年色素形成的方法是防止羰基交联反应。一般来说，羰基应激与防止脂质过氧化产物生成的自由基清除剂和抗氧化剂有关。可是，这是低效的接近预形成的反应性羰基化合物。相反，羰基清除剂通过抑制蛋白质交联预防羰基应激。已经开发了各种晚期脂质过氧化产物(ALE)和晚期糖基化终末产物(AGE)抑制剂，但是大多数的临床试验证明是不能令人满意的，部分是因为副作用。最近开发的晚期脂质过氧化产物(ALE)和晚期糖基化终末产物(AGE)抑制剂或清除剂的长期治疗效果仍有待证明(Terman and Brunk, 1998)。此次研究中，我们会关注毒性低的植物功能成分在治疗羰基应激相关疾病中的应用。

儿茶素是茶叶中主要的功能性成分，在人体健康中扮演重要角色，显示出药理活性并且毒性不确定。积累的证据证明儿茶素防止体内和体外的羰基应激相关疾病(Banach et al., 2009; Lo et al., 2006; Nakae et al., 2008;Noda and Peterson, 2007; Stangl et al., 2007) 最近的研究表明儿茶素表现出显著的抗不饱和醛活性，特别是关于共价加合物，他们与药物氨基胍相比甚至更多的反应(Beretta et al.,2008; Cheng et al., 2009; Sang et al., 2007; Zhu et al.,2009)。另一方面，构效关系研究表明没食子酸酯组，尤其是酰基（在C-3位），大多数都与蛋白质的特异性结合有关，似乎是必不可少的生理活性（Isaacs et al., 2008;Kusuda et al., 2006; Stangl et al., 2007）。分子对接研究表明这些没食子酸酯组儿茶素占据了疏水缝隙，和带正电荷的残基比如赖氨酸、精氨酸、组氨酸可靠地结合（Cao et al., 2009; Leone et al., 2003; Maiti et al.,2006; Pellecchia and Reed, 2004），是许多活性羰基化合的结合位点（Burcham and Kuhan, 1996; Chowdhury et al., 2004; Uchida et al., 1998）。根据上述结果，我们假设除了它们强大的抗氧化功，防止羰基交联反应（羰基应激）可能有一种酯型儿茶素防止羰基应激相关疾病的潜在机制。在本研究中，我们首次检查EGCG在体外的抗羰基应激活性，并且通过将EGCG与其他几种从茶或植物中分离酚类化合物相比较，研究构效关系，我们测试EGCG对在体内形成脂褐素的抑制作用。

材料与方法

材料

高纯度茶儿茶素(-)-表没食子儿茶素没食子酸（EGCG）(ge;98% 纯)，(-)-表儿茶素(EC)( ge;98%),(-)-表儿茶素没食子酸酯(ECG)(ge;98%)和(-)-表没食子儿茶素（EGC）(ge;95%)都是从茶树叶片中分离，两种没食子酸丙酯（PG）(ge;99%)和没食子酸（GA）(ge;99%)都是从植物中分离。人血清白蛋白（HAS）从西格玛购买，1, 1, 3,3-tetramethoxypropane (TMP)（ge;98%）是从Fluka化学公司（布克斯，瑞士）获得。其他使用的化学品都是分析级。

丙二醛（MDA）的制备

根据Kikugawa等人描述的方法水解TMP（Kikugawa et al., 1980）配置新鲜MDA原液（10m mol/L）。

简言之，0.085 mLTMP (0.5 mmol)与4.5 ml 1.0mol/L HCl混合，40℃摇动约2.5min。TMP 完全水解后，用6.0 mol/L NaOH调节pH到7.0，用PBS定容到50Ml,原液在267nm出测量吸光度ε MDA = 31500。

用不同pH值的MDA处理HAS

包含HSA (1 mg/mL) 和 MDA (2.0 mmol/L)的PBS溶液在37℃的热风鼓风干燥箱中孵化24h,加入双蒸馏水，使相应的空白对照。

处理丙二醛修饰的HSA反应系统中的茶儿茶素

150micro;mol/L 到750 micro;mol/L不同浓度的六种酚类化合物（EGCG, EGC, ECG, EC,GA 和PG）加入到HAS或者MDA/HAS反应体系中，37℃的热风鼓风干燥箱24h。加入双蒸馏水，使相应的空白对照。

制备蛋白产物

改性蛋白是先加入五分之一体积20%TCA，再离心（11000 rpm）5min,沉淀再洗两次，目的是移除改性反应中形成的荧光MDA低聚物（Hipkiss et al., 1998）。最后，沉淀蛋白再用PBS溶解，浓度调节至2 mg/mL。

蛋白质产物的荧光光谱分析

用荧光分光光度计法（lambda;ex = 395 nm,lambda;em = 460 nm）对控制或改性蛋白质进行荧光测量，以评估抑制脂褐素荧光的效果。样品在分析荧光数据前稀释5倍或50倍。测试样品的IC50从样品浓度（log）与HSA/MDA体系中脂褐质的荧光强度的对数构成的最小二乘回归线图中获得。

二极管阵列检测器液相色谱法分析茶儿茶素和MDA反应产物

为了明确茶儿茶素和MDA间的反应，用MDA (2 mmol/L)加入Ph7.0的PBS中，37℃24h浸没出茶儿茶素，通过0.45micro;M滤波器。反应产物用Shim pack ODS C18色谱柱（4.6times;150 nm, 5 micro;m）高效液相分析。流动相组成（体积/体积）是：40 N，N-二甲基甲酰胺、2甲醇和1.5乙酸。以下流动相是用来分隔反应体系中的组分：14%流动相0min，在13min线性增加至24%，22min至34%，最后在30min减少至14%。流量是1 ml/min，茶儿茶素的反应产物在278nm处检测，

同时，丙二醛含量在266 nm处用光电二极管阵列检测器（PDA, Shimadzu LC-10 ATVP）检测。

蛋白产物的扫描电镜分析（SEM）

离心蛋白产物混合戊二醛，4℃保存12h及以上。在分析扫描电镜（SEM. JSM-6360LV）分析的蛋白产物表面形态和组成前，扫描电镜样品用涂布机（JEOL JFC-1600）涂布金。

蛋白质产物的红外光谱分析

一个WQF-310-type FTIR光谱仪配备一KBr分束器，用于红外测量。样品的FTIR 光谱在4400 和 400 cm ^-1之间、4厘米^{- 1}标称分辨率中温室下记录，累积64扫描每频谱。空白谱记录以避免任何交叉污染。每个样品都-42℃真空干燥24h去除样品中吸收的水。

红外光谱处理程序

蛋白质二级结构取决于于1700和1600厘米^{- 1}之间酰胺IBand位。傅里叶自去卷积和二阶导数计算用于估计成分条带的数目和位置。基于这些参数，多高斯曲线拟合过程执行在区域1700至1600厘米^{- 1} 酰胺IBand位， 量化每个成分的面积。二级结构单元相应的百分比是从得到的高斯曲线下面积中获得的。

动物与实验设计

从湖南松王动物有限公司（Changsha, P. R. China）获得的健康雌性昆明小鼠，年龄7周，体重约20-25g。它们一般装在塑料笼子里，可以自由进入标准实验室，食物和水在一个12小时的光/暗周期。所有动物仅使用一次。实验动物照顾标准符合中国实验动物管理立法。在实验训化一周后，小鼠随机分为三组（每组8只）：对照组、D-半乳糖模型组和EGCG处理组。D-半乳糖模型组和EGCG处理组的小鼠按照150毫克/公斤体重的剂量皮下注射3% D-半乳糖，每日一次，连续6周，空白组的小鼠用相同体积的生理盐水处理。第三周起，EGCG处理组的小鼠按照6 mg/kg/d剂量用EGCG灌胃处理，对照组和模型组两者的小鼠给予相同体积的媒介物（蒸馏水）4周。所有处理之后，立刻剖析各种实验动物的大脑。

组织学与超微透射电镜（TEM）观察

小鼠大脑在8周去核，立即用2.5%戊二醛、2%多聚甲醛和0.1 mol/L PBS (pH 7.4) 混合物质固定，用于织学与超微透射电镜（TEM）观察。固定30min后，小鼠大脑与固定剂在4℃固定24h后相同。大脑用一系列分级醇脱水，石蜡包埋，5micro;m切片。为了光学显微，切片用苏木精和曙红染色。

醛固定后，获得每只老鼠相同的地方的大脑皮质，1%四氧化锇固定1h，脱水，嵌在环氧树脂中，修剪和切成超薄切片。切片厚度40-60nm厚，安装在未涂覆的网状铜网上，用乙酸铀酰构造 30 min ，柠檬酸铅2 min， 用蔡司900电子显微镜检查。

统计分析

应用于统计分析是软件包SPSS 18.0。测量数据与单向方差分析和重复测量方差分析相比较。结果是描绘的平均plusmn;标准误差（S.E.M）。结果被认为是显着不同的，在p＜0.05水平。

结果

脂褐素样蛋白荧光强度的荧光光谱分析

儿茶素有A环、B环、C环和没食子酰基-D-环（Figure 1），没食子酸酯组的数量和位置是不同的，比如EGC和EGCG的对邻苯三酚（B环）上有3,4,5-三羟基结构，EGCG和ECG在C-3位置（D-环）有没食子酰基基团，EC没有没食子酸酯组。酚类化合物没食子酸（GA）和没食子酸丙酯（PG）两者是分析构效关系辅助成分。

我们的研究显示以上的六种酚类化合物，尤其是EGCG,分别能显著地抑制MDA修饰的HAS和半抑制浓度（IC50）的六种酚类化合物（EGCG, EGC, ECG, EC, PG and GA）的脂褐素荧光强度：144.76, 196.70, 177.57, 430.39, 257.60 and 324.40mu;mol/L（Figure 2）。

Figure 1. Chemical structures of tea catechins, gallic acid (GA) and propyl gallate (PG).

Figure 2. A comparison activities and the IC50 of tea catechins blocking fluorescence intensity of lipofusin in HSA / MDA system.

高效液相色谱法研究MDA修饰的HSA反应体系的产物

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