来自大肠杆菌的两种亚油酸异构酶酶活的比较

原文作者 Xue Luo,Lanwei Zhang,Hongbo Li,Shuang Zhang,Yuehua Jiao,Shumei Wang,Chaohui Xue,Rongbo Fan

摘要：共轭亚油酸CLA是一组含有共轭双键的十八碳二烯酸的位置和几何异构体的通称。CLA具有很多重要的生理功能，它可以通过亚油酸异构酶异构化亚油酸获得。在这篇文章中，我们首先克隆了编码亚油酸异构酶（C12异构酶和C9异构酶）的基因。然后将重组质粒导入到大肠杆菌TOP10中,并用IPTG(异丙基-beta;-D-硫代半乳糖苷)诱导表达重组蛋白。接下来，我们用HisTrapTM HPcolumn纯化了异构酶，然后用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Western blot（蛋白质印迹法）进行分析。最后我们通过LA转化为CLA的转化率来比较两种亚油酸异构酶的酶活。实验结果显示包含亚油酸异构酶基因的质粒被成功地构建。亚油酸异构酶在大肠杆菌中成功表达，分子量为64KD(千道尔顿)的为C12亚油酸异构酶，分子量为55KD(千道尔顿)的为C9亚油酸异构酶。在IPTG的浓度为0.2Mm，诱导时间为18h时两种亚油酸异构酶的酶活都达到了最高（C12亚油酸异构酶的酶活为9.93 plusmn; 0.01 U/ml，C9亚油酸异构酶的酶活为8.12 plusmn; 0.02 U/ml）。纯化后 C9 LA异构酶富集在峰4，C12 LA 异构酶富集在峰3. C9 LA and C12 LA异构酶的最适pH分别为7.5和7.0，最适温度为37℃时，CLA的浓度最高。这个项目将为CLA用于药品和功能产品的有效生产过程提供理论意义。

关键词：亚油酸异构酶 共轭亚油酸 His-tag蛋白纯化法 酶活 十八碳二烯酸

引言：共轭亚油酸是一系列含有共轭双键的亚油酸的位置和几何异构体的混合物。天然的CLA异构体作为一个小组分存在于反刍动物肉、奶的脂质中[1]。CLA的天然供给不足导致化学合成CLA [2, 3]。然而由于化学合成CLA的专一性差，纯化的成为适用于营养产品和药物的成本高，难度大。而生物技术方法能有效地生产得到高纯度的CLA[4, 5]。在过去的30年中，顺-9，反-11-共轭亚油酸（c9，t11-CLA）和反式10，顺12-CLA（t10，c12-CLA）的异构体已被证明对动物和人都有很多益处。不同的CLA异构体由于细胞信号传导途径不同而具有不同的生物学效应[6–8]。例如，c9，t11-CLA能抑制癌变的开始和肿瘤发生，提高免疫力，改善糖尿病患者生活，减少动脉粥样硬化[4，9-12]，而t10，c12-CLA可以通过改变低密度脂蛋白/高密度脂蛋白胆固醇的比值来改变身体成分和骨的形成，并减少脂肪含量和增加肌肉质量[12，13]。c9，t11-CLA已被证明是厌氧瘤胃细菌溶纤维丁酸弧菌氢化LA的生物第一中间产物 [14]。痤疮丙酸杆菌和费氏丙酸杆菌可以用来生产t10，c12-CLA，但这些种类的细菌并不是主要的瘤胃细菌。

我们都知道CLA可以通过亚油酸异构酶转化LA而来。到目前为止，已经发现了两种亚油酸异构酶：C12异构酶和C9异构酶，C12异构酶可以把亚油酸转化成c9, t11- CLA，这种亚油酸异构酶可以从多种细菌中得到，如溶纤维丁酸弧菌，罗伊氏乳杆菌，植物乳杆菌，和嗜酸乳杆菌。在埃氏巨型球菌，痤疮丙酸杆菌和费氏丙酸杆菌中可以检测到C9异构酶，这种酶可以将LA催化生成t10, c12 -CLA [15–17].在这篇文章中，我们把这两种异构酶（C12异构酶和C9异构酶）表达到大肠杆菌中，经过柱洗脱法纯化后，检测它们的酶活，最后比较它们的生物学性能。这篇文章将为满足CLA在医药及营养领域的应用提供了提供了理论依据。

方法

材料和菌种

从Fermentas公司购买的DNA限制酶购。

从Sigma公司购买的CLA标准品和LA标准品。

从OMEGA公司购买的基因组DNA提取试剂盒，质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒。

痤疮丙酸杆菌ATCC6919，是厌氧细菌，是从美国模式培养物集存库（ATCC）购得。它们在37℃，有氧条件下，1053液体培养基中或质量体积分数为1.5-2%葡萄糖琼脂培养基中培养不需要搅拌。

罗伊乳杆菌ATCC55739，兼性厌氧菌细菌，也购自ATCC。嗜酸乳杆菌F0221，兼性厌氧菌菌，是从人肠道中分离而来[18]。它们在30℃，MRS液体培养基或质量体积分数为1.5-2%葡萄糖琼脂培养基中培养不需要搅拌。

克隆过程中的宿主细胞是大肠杆菌TOP 10。重组蛋白分别被表达在大肠杆菌Rosetta（DE3）和BL21（DE3）中。它们在需氧条件下培养于LB液体培养基中或质量体积分数为1.5-2%的葡萄糖琼脂培养基中，并添加用适当的抗生素来选择。

克隆编码LA异构酶的基因

用DNA试剂盒（OMEGA，D3350-01）分别从痤疮丙酸杆菌，罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌中提取基因组DNA.

为了促进细胞裂解，向重悬的细胞中加入溶菌酶（2㎎/ml,最终浓度）。把混合物在37℃下培养1小时，接着加入蛋白酶K（100ul/ ml，最终浓度）。

根据美国国立生物技术信息中心（NCBI）亚油酸异构酶的基因序列设计三对引物（来自于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶(基因 ID: AX062088), 来自于罗伊氏乳杆菌的亚油酸异构酶（基因ID：AX062045）和来自于嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶（基因ID：DQ239438）。（表1）每个引物都包含一个限制性位点（在表1中加了下划线），黑体大写字母代表基因组DNA序列的一部分，小写字母代表人工合成的序列（如限制性位点和加入的碱基），以2ul的DNA作为模板，加入Taq DNA聚合酶，用PCR扩增亚油酸异构酶基因。

PCR反应体系总量是50ul，包括1uM的上游引物和下游引物，0.16mM的Mg2 ,1times; Taq缓冲液，0.2mM的dNTPs和0.1U/ul TaqDNA聚合酶。PCR的条件如下：94℃，5min预变性循环一次，94℃，30s的变性，30s的退火（来自罗伊氏乳杆菌的亚油酸异构酶基因的退火温度是54℃，来自于嗜酸乳杆菌和痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的基因的退火温度是50℃），72℃，90s的延伸循环30次，最后一个是72℃，7min的循环。PCR反应的产物用质量体积分数1%的琼脂糖凝胶电泳跑胶，显示PCR条带，然后用胶回收试剂盒（OMEGA，D2500-01）切胶回收纯化产物。

把亚油酸异构酶和pMD18-T载体用XhoI 和 EcoRI 或 SacI 和 PstI 酶进行双酶解，然后用用T4DNA连接酶在16℃下进行连接，连接后得到pMD18一C12LA，pMD18一C9LA。

重组质粒用相同的酶双酶切确认正确克隆后，转化到大肠杆菌 TOP10中。大肠杆菌TOP10的感受态是根据Mandel 和 Higa的方法制备和转化的[19]。在Invitrogen公司进行DNA测序来并使用DNASTAR软件进行序列分析[20]。

亚油酸异构酶的表达和纯化

用质粒小量提取试剂盒(OMEGA, D6943-01)分离来自于大肠杆菌TOP10的重组质粒DNA, 用XhoI 和 EcoRI 或 SacI 和 PstI酶切带His-标签的pCold-SUMO质粒和重组的pMD18-T质粒，用胶回收试剂盒纯化酶切后的质粒，然后用T4 DNA连接酶在16℃进行连接。将重组的质粒转化到 大肠杆菌Rosetta (DE3) 和 BL21 (DE3) 中. 然后用含有100 ug/ml氨苄青霉素LB液体培养基（100ml）在37℃下过夜培养，当OD值达到0.6时，加入0.2 mM异丙基-beta;-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在16℃下进行诱导。

将菌液离心后倒掉上清留下沉淀，4克湿细胞沉淀用20ml结合缓冲液（20mM磷酸钠，0.5M NaCl和20mM咪唑，pH值7.4）重悬。用超声破碎仪在400W下进行破碎，破碎后在10000times;g，4℃下离心20min, 然后将上清液通过0.22的DuraporeTM膜过滤器过滤。将样品倒入用结合缓冲液在AKTA纯化器上平衡过的HisTrapTM HP (GE Healthcare公司）层析柱上。将流速设置成1ml/min，先用5-10柱体积（CV）的蒸馏水清洗，然后用至少10CV的结合缓冲液清洗，直到在UV280nm处的吸光度值稳定在基线。蛋白质作为通过柱子的上清液被收集。用10CV的从0到100％的洗脱缓冲液（20mM磷酸钠，0.5M NaCl和500mM咪唑，pH 7.4）梯度洗脱蛋白。每个洗脱梯度分别被收集1ml，并通过SDS-PAGE或Western blot进行分析。用于Westernblot的抗体为如下：抗-his抗体（TianGene，AB1010）作为初级抗体，AP缀合的山羊抗小鼠抗体（Millipore公司，AP124A）作为第二抗体。

重组蛋白酶的生物活性

亚油酸异构酶的生物活性之一就是将LA转化为CLA.用0.1M,pH为6.5的磷酸缓冲液加入10ul的重组蛋白在37℃孵育3h检测亚油酸异构酶的酶活。用全细胞悬浮液或之前说的酶的提取物来检测亚油酸异构酶的酶活[21]。亚油酸异构酶酶活的定义：在室温下，在1min中内转化生成1ulCLA的酶量[22]。.生成的CLA被甲酯化后变成CLA甲酯，用装配有火焰离子化检测器的气相色谱（GC），HP6890的柱子来检测[23]。检测器和注射器均保持在在250℃。不分流进样后，将柱子（HP-88，100微米，0.25毫米ID）温度在120℃保持1分钟，随后以10℃/min的速率增加至175℃C，再以5℃/min的速率增加至210℃，并在210 C 保持5分钟后，将温度以5℃/min的速率升高到230℃，并在230℃保持5分钟。蛋白浓度测定用蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，上海，中国），使用牛血清白蛋白做为标准蛋白。

结果与讨论

亚油酸异构酶基因的克隆和序列分析

为了得到亚油酸异构酶的重组蛋白，把从罗伊氏乳杆菌，嗜酸乳杆菌和疮疱丙酸杆菌中获得的编码亚油酸异构酶的基因用PCR扩增，然后把该基因被克隆到包含有his-标签的细菌表达载体pCold- SUMO中，命名为pCold-C12LAI和pCold-C9LAI，并表达在大肠杆菌Rosetta（DE3）中。DNA测序表明成功构建了含有LA异构酶基因的质粒。

从罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌中得到的1776 bp的基因编码了LA异构酶蛋白质的591个氨基酸。这个LA异构酶可催化LA变成C9，T11-CLA，因此，它是C12 LA异构酶。C12LA异构酶基因与NCBI数据库的序列的比较结果表明，C12 LA异构酶与NADB-Rossmann超基因家族有显著得同源性。

从痤疮丙酸杆菌中得到的1275 bp的基因编码了LA异构酶的蛋白质的424个氨基酸，这种LA异构酶蛋白可以催化LA成为t10,c12-CLA，所以它是C9 LA异构酶。与数据库中的序列比较显示，克隆异构酶蛋白与氨基酸氧化酶有显著同源性，同时与NADB-Rossmann超基因家族也有同源性。

亚油酸异构酶的表达与纯化

为了得到重组亚油酸异构酶，把两种质粒pCold-C12LAI和pCold-C9LAI都转化到大肠杆菌Rosetta（DE3）中，并加入IPTG进行诱导。结果表明C9 LA异构酶和C12的LA异构酶都能在大肠杆菌（DE3）中表达（图1a，b）。而且可由Western blot图证实（图1c）。他们的分子量也跟预期的一样：C12LA异构酶64

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