反-10，顺-12共轭亚油酸在含油解脂耶氏酵母中的从头合成

原文作者 Baixi Zhang2, Chunchi Rong2, Haiqin Chen2, Yuanda Song1,2*, Hao Zhang2*and Wei Chen1,2

摘要：

背景：共轭亚油酸（CLA）已经有许多充分的证据证实其生理功能具有效作用。由于共轭亚油酸的自然供给不足且化学方法生产的共轭亚油酸特异性低，若要用作药用和营养目的还需要一种有效生产共轭亚油酸特异性异构体的方法。

结果：来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶基因在解脂耶氏酵母中成功表达。对于PAI密码子的选择优化和多拷贝整合显著提高了PAI在解脂亚罗威阿酵母中的表达水平。反式10，顺-12共轭亚油酸在携带优化密码子基因的酵母中的比例比携带原生基因的酵母高出六倍。结合多拷贝整合,生产产量将提高到大约30倍。在解脂亚罗威阿酵母中，反式10，顺-12共轭亚油酸的产量达到总脂肪酸产量的5.9％

小结：这是在含油解脂亚罗威阿酵母中生产反-10，顺-12共轭亚油酸的的第一份报告，并且使用葡萄糖作为亚油酸异构酶在痤疮丙酸杆菌中表达的唯一碳源。

关键词:共轭亚油酸，亚油酸异构酶，密码子优化，多拷贝整合，痤疮丙酸杆菌，解脂亚罗威阿酵母

背景

共轭亚油酸（CLA）是一个通用术语，应用于描述含有共轭双键的亚油酸（LA）的混合物的位置和几何异构体。 在过去的三十年中，由于共轭亚油酸在生物学功能方面具有益作用，已经吸引了人们的大量注意力。 这些作用对象包括动物模型和人类，例如抗致癌，抗动脉粥样硬化，抗糖尿病，抗炎和抗肥胖性能。迄今为止，有三种共轭亚油酸的同分异构体被证明具有有益效果，它们分别是：顺式9，反式11 CLA，反-10，顺-12CLA和反式9，反式11的CLA。不同的异构体通过对不同细胞路径发射信号从而对它们的新陈代谢和行为方式产生不同影响[1-3]。

在自然界中，共轭亚油酸的异构体来源于反刍动物衍生出脂质的次要组分制成的的肉类和奶制品中。如今，CLA作为膳食补充剂，一般是从红花和向日葵油中提取出的LA通过碱性异构化制成，同时，其附加的功能由同分异构体的形成所决定[4]。此外，在绝大多数有关于CLA对人类志愿者的有效性研究中，共轭亚油酸的混合物已经替代了纯的异构体并被用于补充，但是其结果往往是有争议的。因此，[5,6]为了满足药用和营养目的的要求，CLA异构体必须具有生物安全和高度特异性。而解决这些问题的关键可能就在于生物生产的CLA，比如业界公认的的是LA异构酶催化LA转化成共轭亚油酸异构体。早在1965年，Tove和他的同事证明了从厌氧瘤胃细菌溶纤维丁酸弧菌提取出的LA存在着LA异构酶活动生产的顺式9，反式11 CLA。到目前为止，只有三种LA异构酶得到了充分的表征，它们分别来源自罗伊氏乳杆菌，生孢梭菌和丙酸杆菌粉刺。前两个异构酶是顺式9，反式11-CLA和反式10，顺12-CLA，可用于制备异构酶[7]。从丙酸菌中产生的[8,9] LA异构酶(PAI)是唯一具有LA异构酶的晶体结构特征的酶[10],它被依次表达在大肠杆菌[11]，酿酒，酵母，烟草种子[12]，稻[13]和乳酸乳球菌中[14]。

PAI不像其他的酶诸如脂肪酰去饱和酶与脂肪酰延伸酶，PAI使用游离脂肪酸作为唯一的基材。因此，无论是磷脂酰胆碱，normethyl-，辅酶A，LA或triacylglycerol-酯都可以作为它的基材被接收。不幸的是，游离脂肪酸在多数真核生物中的含量是很低的，因此这成为了共轭亚油酸生物合成[12,13]的主要限制因素。然而，也有一个例外，一种名称为解脂亚罗威阿酵母的含油酵母能够在胞内积聚数量显著的游离脂肪酸[15]。此外，它可以积累大量的脂质（gt;的细胞干重的25％）并且LA在脂肪酸组合物[16]里的比例很高。因此，这种非传统含油酵母--解脂亚罗威阿酵母，在本研究模型中被作为范例，调查由内源性LA生产的反式10，顺12-CLA与其来自于丙酸杆菌中过度表达LA异构酶功能的内源性LA。

结果

PAI基因密码子优化

作为天然PAI序列的不同密码子，是从解脂亚罗威阿酵母首选出新创密码子根据其优化版本的基因设计与合成。在该基因的优化版本中，所有的密码子里有48％的密码子被Y. lipolytica-favored取而代之，同时，AT/ GC的比率也由其主体所调节。密码子适应指数(CAI)从0.76(自然顺序)改善到了0.91(合成基因)(图1)。此外，科扎克元素前加入第一个AUG密码子，可以防止核糖体扫描的遗漏。作为天然的PAI，合成基因的翻译产物与其有相同的氨基酸序列。在测试PAI表达密码子优化的有效性时，这两种天然序列（PAI）和密码子优化的序列（OPAI）被用于表达在解脂亚罗威阿酵母中。

重组酵母菌株的构建

单拷贝载体pINA1312和多拷贝载体pINA1292被用于在解脂中表达Y. PAI。 pINA1312包含无缺陷ura3d1基因作为单拷贝的表达，而pINA1292包含有缺陷ura3d4基因，用以减轻主体的尿嘧啶营养缺陷[17]，因此这在多个副本中是必须的。经过2~3天的培养，转化体与非缺陷矢量上出现YNBD；而转化体与缺陷矢量经过4~6天的潜伏期可以观察到。单菌落分离物根据菌株，质粒，基因和克隆命名如下：POLH-1312-PAI-1代表株POLH，质粒pINA1312，PAI基因和克隆号1。七polh - 1312 pai转化株,十二polh - 1312oPAI转化株和十三polh - 1292 oPAI转化株通过PCR分析被随机选择和快速确认。

PAI拷贝数在解脂亚罗威阿酵母转化体

在转化株之间的多拷贝过程中，一定数量的拷贝数可以通过综合性的盒式表达式被预估使用，这是经过rt - pcr分析后而获得的数据。解脂POLG被用作对照生物体只有单个副本包括URA3和SUC2靶序列。如URA3和OPAI并存的表达盒中，这两个基因的拷贝数被认为是相等的。PAI副本的分析数据分布在13个孤立的polh - 1292 opai转化株中，如图2所示。对于所有克隆测试，拷贝数范围在6~24之间，平均拷贝数/细胞为12~13。其中所包含的大部分转化体（9个克隆）在10~16拷贝数/细胞之间。最高拷贝数为24，如POLH-1292-OPAI-5所示。

PAI的解脂异源表达

在酵母转化株中，重组PAI的表达水平使用免疫印迹的技术来分析，它是对来自大肠杆菌中的重组PAI采取特异性多克隆抗体。重组PAI出现在所有携带大约50 kDa分子大小oPAI（图3b和3c）的酵母转化株中，这也与PAI的分子量大小一致。通过比较，PAI从天然PAI中表达出来的产率极低，并且不可能通过Western被检测得到，除了两种转化株（分别是POLH-1312-PAI-3 和 POLH-1312-PAI-4）（图3a）。同时，还观察到，在多拷贝转化体POLH-1292-OPAI中转化PAI的表达水平显著高于单拷贝转化体OPAI（图3b和3c）。此外，PAI表达水平在各个携带相同表达盒的转化株单体中是不同的（图3）。

PAI在解脂亚罗威阿酵母中的活性

在这项研究中， LA转化成CLA的比率表示PAI的活性。根据PAI的表达水平， 6代表转化株的转化率最佳或者平均在每个系列中选择PAI酶活性的体外测定。在这些挑选出来的转化株中，PAI活动(图4)的表达水平与PAI附近的线性水平有关(图3中,相对密度数据未显示)。这一现象表明，PAI的“特定活动”在不同的转化株之间是具有可比性的。80％的最大转化率是从转化株POLH-1292-OPAI-5获得。 PAI活动在转化株POLH-1312-PAI-2和对照菌株（POLH-1312和POLH-1292）中是检测不到的。

CLA在解脂亚罗威阿酵母中的生产

为了从PAI转化株中检测到可能产生共轭亚油酸，脂质可以从这些细胞和FAME产品中提取的脂质制备而得来。脂肪酸甲酯的定性和定量检测是通过GC和GC / MS进行分析的。在图5和表1所示的结果显示，转化体和对照菌株在总脂肪酸的组成上除了一个新的高峰以外都没有显著差异，这样的现象目前仅在转化株中观察到，但无法在对照菌株中观察。通过与真实有效的商业标准进行比较后得出新产生的FAME为反-10，顺-12共轭亚油酸。此共轭亚油酸异构体的同一性通过GC / MS（图6）被进一步验证。

对应于免疫印迹的结果，在所有的酵母转化株中，反-10，顺-12共轭亚油酸在含有最佳优化基因OPAI的酵母转化株中被检测出来，但是只有两个转化体中包含了PAI的天然基因（POLH-1312-PAI-3和POLH-1312-PAI-4）。此外，在具有相同表达盒的各个菌株中CLA的产量由于PAI表达水平的不同变化较大。在含有天然PAI的转化酵母中，共轭亚油酸的的最大含量仅为总脂肪酸（重量/重量）的0.2％。 相比之下，在所有的OPAI单拷贝转化株中，共轭亚油酸转化浓度为0.2％以上，最大浓度为1.2％。此外，在OPAI多拷贝转化株中，CLA的平均含量进一步提高到3.4％，CLA的最大浓度达到5.9％（表1）。PAI的密码子优化致使了CLA的最高产量呈现了6倍的增加。随着多拷贝整合的改进， PAI单拷贝转化株的转化量得到了约30倍的增长。总之，我们的免疫印迹分析包括在体外酶活性测定和体内的CLA产量分析结果表明：CLA比率的增加是由于PAI在这些酵母转化株中的表达水平增强。

讨论

迄今为止，来源于痤疮丙酸杆菌的LA异构酶是目前唯一已知生化特征和晶体结构的LA异构酶，通过彻底的调查分析，它还存在潜在的生物技术应用。然而，由于PAI的唯一底物是游离脂肪酸，一种存在于大多数微生物和植物的次要组分中的化合物，因此难以通过PAI遗传工程技术产生足够的反式10，顺12共轭亚油酸。一些研究已经报道，通过将PAI导入烟草种子和水稻的生物转化法来生产CLA，这些转基因植物生产共轭亚油酸的量分别仅为总脂肪酸含量的0.3％和为1.6％[12,13]。一种适合共轭亚油酸生产的生物合成系统尚未发现。

为了解决这个问题，解脂亚罗威阿酵母在这项研究之中被选为PAI表达和生产的CLA的宿主菌株。解脂亚罗威阿酵母是目前唯一一种已开发出特定遗传工具并且有能力积累大量游离LA能力的含油酵母[15]。我们的研究结果表明，转化的解脂亚罗威阿酵母能产生相当数量的共轭亚油酸，同时，共轭亚油酸的生产将通过已进行密码子优化的基因多拷贝表达而得到增加。

在先前关于酿酒酵母的研究中，通过优化PAI的20 N-末端氨基酸残基后使PAI表达得到改善[12]。在我们的研究中，将PAI基因的全长进行了优化，并如预期，密码子优化作为提升转换效率的途径从根本上增强了PAI的表达（图3）。

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