辐射物理与化学

——利用gamma;射线对意式肉肠肉毒杆菌的使用控制制定不同的亚硝酸盐的含量

Monalisa PereiraDutra , Gleacute;ciadeCaacute;ssiaAleixo , Alcineacute;iadeLemosSouzaRamos , Mauriacute;cio HenriquesLouzadaSilva , MarcioTadeuPereira , RobertaHilsdorfPiccoli , Eduardo MendesRamos

摘 要

本研究应用不同剂量的gamma;辐射（0,10和20kgy）对接种在不同亚硝酸盐含量TS（0，150和300ppm）的意式香肠上的肉毒梭菌孢子（107孢子/克）进行影响研究。我们也评估了热的应用顺序（烹饪）和辐照处理。对产品肉毒梭菌的存活量，pH，水活性（AW），氧化还原电位（EH）和亚硝酸盐残留量进行了评价。在非照射面，不添加亚硝酸盐时几乎所有的孢子可以恢复而添加150 ppm的亚硝酸盐时只有一半可恢复。未经辐照处理的意式香肠在48h后通过150 ppm亚硝酸盐的使用能够抑制其中肉毒梭菌的萌发或生长。然而，经过30天的低温储藏（4摄氏度）后，这种微生物有可能恢复到105 UFC/克。gamma;辐射（大于10kGy）对意式香肠中肉毒梭菌的失活、亚硝酸钠使用水平的独立性以及烹调/辐照加工顺序有着积极作用。

关键词：肉制品； 细菌芽孢； 亚硝酸盐还原

1. 引言

固化的盐是对于腌制腊肉制品的颜色开发、特有味道和香气以及抗氧化酸败所必不可少的添加剂。然而，肉制品中的亚硝酸盐/硝酸盐的主要作用是其对厌氧微生物的防腐作用，特别是肉毒梭菌（Cassens，1995；Shahidi and Hong，1991）。

在肉毒毒素的控制方面，一旦肉制品中亚硝酸盐的添加有一个良好的记录（Pierson和Smoot，1982；Shahidi and Hong，1991），就可以排除或减少在固化产品配方方面涉及的食品安全担忧。然而，关于在肉制品中使用亚硝酸盐而形成的风险产物亚硝胺，这种被证明有致突变和致畸致癌性质的化合物被日益关注。亚硝胺可在食品加工过程中形成，也可以在体内经过胃肠道的反应（硝化）形成仲胺衍生物（Sebranek and Bacus,2007），可以与胃，肝，食道癌症的高风险相关联（Hill，1988）。因为这种风险，研究已经提出了替代的方法来取代或至少减少亚硝酸盐的增加。

减少肉制品中亚硝酸盐的一个可行的替代方案是使用gamma;辐射诱导残留亚硝酸盐的辐解和N-亚硝胺执行（Ahn等人，2002，2004; Jo等人，2003）。

在肉制品中使用gamma;辐射，特别是在使用高剂量的gamma;辐射时产生的电阻，是由于其质量特性的不良变化产生的，例如质地，颜色，香味和风味的损失，包括在水中形成的羟基自由基诱导辐射布鲁尔（2009）。 Dutra etal. (2011) 和 Sindelar 以及 Milkowski(2012)评估了用不同浓度的亚硝酸钠（0,75and为100ppm）配制意式肉肠的技术和质量特性，以及通过施加不同的辐射剂量（0,7.5and15kGy）所产生的效应。虽然在用递增剂量的辐射的脂质氧化有稍微增加，在与亚硝酸盐添加产品的质量没有显著变化，此外，这些研究人员观察到即使有高辐射剂量的应用（15kGy），少量的亚硝酸盐（为75ppm）都足以让颜色固化。

然而，肉毒梭菌似乎是致病性细菌，形成的孢子更耐电离辐射（Anellis and Koch,1962; Dutra etal.,2014），需要30kGy以上的剂量应用于肉与肉制品中以达到商业无菌。结合使用加入辐照的亚硝酸盐可以作为灭活微生物抗性的肉毒杆菌的替代。此外，对热辐射等因素的应用顺序也可能影响这些微生物失活的程度，第一个因素可以用于脱敏，第二因子诱导孢子萌发。

本研究的目的是评价高剂量gamma;辐射，单独或与烹饪过程组合的应用程序的影响，以及对肉毒梭菌孢子接种在不同亚硝酸钠配制的意式香肠中的存活量。

1. 实验材料和方法

在存活的肉毒梭菌孢子中不同亚硝酸盐的水平（0，150和300ppm）和不同照射量（0，10，20kGy）的影响在五个中央旋转组合的实验中进行的评估，并在一个优化的实验中进行了阐述（Dutra等人.2015,2014）,如下所述：

实验1（CCRD 实验5）：无亚硝酸盐和10kGy量照射的样品

实验2（CCDR 实验7）：150ppm的亚硝酸盐和无照射条件

实验3（CCDR 实验9）：150ppm的亚硝酸盐和 10kGy量的照射的样品

实验4（CCDR 实验8）：150ppm的亚硝酸盐和20kGy量照射的样品

和实验5（CCDR 实验6）： 300ppm的亚硝酸盐和 10kGy量照射的样品

化学和物理分析也在这实验中被用到去辅助论证孢子存活的结果。在此实验中有两组重复实验。

2.1微生物的使用，保证培养物纯种和标准化的接种

D型肉毒梭菌，全国农业实验室曾使用过的一个品种。被冻干过的菌株在含有等体积的4%亚硫酸钠（重量／体积）和7%柠檬酸铁溶液中再生。之后在将等分试样（0.1ml）的培养物放入孢子形成的培养基琼脂表面，并在37摄氏度的厌氧条件下培养48小时。培养物在35摄氏度的环境下培养5天之后，用盐水洗涤，转移到微管当中并在3600转的转速下离心10分钟。导出的细胞悬浮液在盐溶液中70摄氏度条件下加热30分钟。孢子悬浮液与上述相同的条件下再次离心并弃去上清液。被冷冻介质（300ml甘油，5g肉类中的蛋白胨，酵母提取物3g，5g氯化钠，混合在1000ml的水中，pH值7.2plusmn;0.2）覆盖的沉淀（细胞和孢子）在实验进行期间被保存着等待使用。

2.2 肉肠的配方和加工

肉肠的制备是在DCA／UFLA的肉类实验室中进行的，根据以下配方：猪肉卷（57.5%）猪背膘（14.5），水/冰（20.0％），盐（2.0％），木薯淀粉（5.0％），抗坏血酸（0.054％），多磷酸盐Fosmax320（0.5％）和肉肠的调味品（0.5）。肉肠通过加入不同水平的的亚硝酸盐（0，150，300ppm）通过KJ－10切割机处理然后和面糊一起填充到聚酰胺的肠衣中。

肉肠被分为两批进行不同的过程进行处理：（1）烹饪和照射至内部温度达到73℃，并在4℃下冷冻24小时，然后在gamma;射线照射下冷冻24小时（4℃）。（2）对进行冷冻24小时的面糊进行照射和和烹饪，gamma;射线照射烹饪（直到内部温度达到73℃）然后再次冷冻24小时。到此，所有的步骤进行了48小时。这样，两个样品分别进行了各自的处理，其中一个在处理后马上进行测定，另一个样品在4℃下冷藏30天后进行测定。

该产品，熟食和生食，被装在冷却器中，进行不同辐射剂量的照射（10和20 kGy），在核技术发展中心的gamma;射线中心中使用GB－127gamma;射线（（R-214，MDS Nordion公司，用钴-60源和5kGy/小时的速度）进行处理。未照射的样品被保存在和进行照射处理样品相同的温度和时间下。

2.3 孢子接种

为了进行微生物的分析，把面糊分成25g每份并装在尼龙塑料袋中，在其中接种上肉毒梭菌孢子（107 CHU／g）并放在匀浆机中匀浆2分钟（490转／分钟）。真空密封后，将两个样品进行不同的处理：烹饪；gamma;射线照射；先烹饪再gamma;射线照射；先gamma;射线照射再烹饪。对于这些肉肠的照射和烹饪的程序都是相同的，这些程序都进行了48小时。烹饪再照射和先照射再烹饪的两组处理方式是两个时间点：在处理完成后马上进行测定；在4℃下冷冻30天后再进行测定。

2.4 营养细胞和肉毒梭状芽孢杆菌孢子的量化

打开含有接种孢子的肉肠，加入9ml含有0.1%蛋白胨溶液，然后在匀浆机中以490转／分钟的速度匀浆2分钟。

为了对肉毒梭菌细胞进行计数，对均匀的混合物用含有0.1%水的9ml蛋白胨进行稀释，等分为100ml每份，转移到针对肉毒梭菌的分离培养基中。培养基在37℃的厌氧条件下培养48小时，使用厌氧罐和厌氧条件电动机进行环境控制。

为了计数肉毒梭菌孢子的数量，将匀浆的物质进行等分后，进行加热处理（75℃／15分钟）以使其细胞失去活性和降低孢子的活性。在9ml的0.1%蛋白胨溶液稀释后，等分（100ml）接种在介质中，以隔绝肉毒梭菌，然后在37℃的有氧环境下培养，用厌氧罐和厌氧环境电动机控制环境培养15天，每48小时进行定期测定。

2.5化学和物理化学分析

通过与插入电极相结合（参考系统为银/氯化银），类型渗透，电位计DM20耦合，在这三个不同的层面对意式香肠进行pH测定和氧化还原电势评估。在流体实验室测定水分活性，并根据美国分析化学家协会（AOAC)规定的NO.973.31方法测定剩余亚硝酸盐含量。每个实验进行两次重复。

2.6统计分析

在每个CCRD试验中进行两次重复。描述性统计用来分析肉毒杆菌在试验中的存活率。对意式香肠的亚硝酸盐和gamma;辐射在化学和物理化学特性方差分析的置信水平为5%。对每一个试验，数据记录在一个2（煮熟/辐射 和 辐射/煮熟）x2（0天和30天）的表格当中。这些影响不是本文客观研究，所以仅仅用来描述支持孢子存活率的讨论。

外文文献出处：辐射物理与化学119(2016)125–129

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