肉桂提取物对胡萝卜-金诺橘混合物中O157:H7型大肠杆菌的失活作用

Moushumi Ghosh·Sarvnarinder Kaur·Abhijit Ganguli

摘要：我们研究了在实验室制备的肉桂提取物对胡萝卜-金诺橘混合物中O157:H7型大肠杆菌的抑菌效果。将鲜榨的胡萝卜和金诺橘果汁混合得到典型混合物，在含有和不含有肉桂提取物（0.3%）的培养物中接种10²CFU/ml的O157:H7型大肠杆菌，并在4,8和28℃下储存10个小时。每两小时在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）选择性培养基（麦康凯山梨醇琼脂）和薄琼脂层（TAL）上计数。TAL的方法是用于恢复亚致死损伤的细胞。含有0.3%肉桂提取物的混合物对O157:H7型大肠杆菌的失活作用明显，尤其在28℃下更具杀伤作用，类似的趋势在冷藏条件下（4和8℃）储存的混合物中也有体现。数量的减少归因于几个因素，即pH值，储存温度和肉桂的添加。我们的研究结果表明，在制备印度流行的健康饮料胡萝卜=金诺橘混合物时，肉桂提取物可以作为一种天然有效的抗菌剂以保证消费者的安全。

关键词：未经高温消毒的；胡萝卜-金诺橘混合物；肉桂提取物失活作用；O157:H7型大肠杆菌

1. 背景介绍

对食源性疾病爆发日益增加的忧虑，促使全球各地研究人员找寻保证食品安全的方法，其中之一是使用来自微生物和植物来源的天然抗菌剂的方法。一些香料、调味品和植物提取物有很强的药用、防腐和抗氧化的特性^[1]。这些成分的抗菌活性是由于它们的精油，这些精油具有亲脂性，能通过膜渗透到细胞内部，并在目标点抑制活性。肉桂能有效抑制细菌的生长，但革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌更为敏感^[1]。在过去的30年间，除其他肠道致病菌之外，大肠杆菌已经成为最重要的人类腹泻病原体之一；在世界各地均有报道过由于饮用未经高温消毒的苹果汁和橙汁而导致因大肠杆菌引发的食源性疾病爆发的消息^[2][3][4][5]。发展中国家，特别是温度有利于该菌增殖的热带地区的发展中国家，通过腹泻病的高患病率反映出这个事实^[6]。然而，可能因为这种病原体最近才出现，在这些国家几乎没有分离它们的报道。在印度，O157:H7型大肠杆菌菌株已经从急性腹泻患者、未经高温消毒的橙汁、健康的牛和牛肉样本中分离出来^{[7][8][9][10][11]}。尽管O157:H7型大肠杆菌菌株越来越多的从次大陆地区分离出来，但还没有研究对流行的传统饮料中的这种病菌进行评估，因此，还没有相关的失活研究来解决在流行饮料中天然抗菌剂的效用问题。

饮料，包括鲜榨果汁，在印度的首都和其他大城市都拥有大量（所有年龄组和社会经济谱）消费者。胡萝卜和金诺橘（柑橘鳙鱼times;柑橘美味）作为优选的新鲜鲜榨果汁源，在10月到3月间大量生产^[12]。胡萝卜金诺橘混合物，即由鲜榨胡萝卜和金诺橘制备而来的果汁，享有广泛的知名度。我们最近从为制备这种混合物的胡萝卜汁中分离出O157:H7型大肠杆菌，在这种混合物中消费的时期，病原体被证明在环境温度下存活和生长。因此，我们的工作目的是，在制冷和环境储藏温度下，评估肉桂提取物对由胡萝卜和金诺橘制备的混合物中的O157:H7型大肠杆菌的失活作用的潜力。

1. 实验材料与方法

菌株：在整个研究过程中使用O157:H7型大肠杆菌ATCC43895。储存条件保持在4℃，并每周向胰蛋白酶大豆琼脂转移（TSA，Difco公司，底特律，美国）。有机体在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB，Difco公司，底特律，美国）于37℃下培养18个小时；在实验前，将接种物连续3次转移到TSB，间隔时间为24小时。

培养制备：将细菌通过离心沉淀（4000xg，20分钟），在0.1％胨水中洗涤三次并用0.1％蛋白胨水调节，以获得约10⁴CFU /ml的细胞数。

胡萝卜-金诺橘混合物样品的制备、接种和储存：用70%的乙醇对完好无损的、健康的胡萝卜和金诺橘的表面进行消毒，并放置在用抗菌肥皂和沸水反复消毒过的家用榨汁机中。每100ml混合物由40ml胡萝卜汁和60ml金诺橘汁组成。将新鲜制得的100ml胡萝卜-金诺橘混合物等分置于无菌瓶中。将肉桂（0.3%重量/体积）加入到该混合物中，与缺乏肉桂的的混合物进行控制对照。将培养物（1ml）等分接种到混合果汁样品中，以获得每毫升约10⁴个细胞数。接种的样品分别在4℃、8℃和28℃下培养10小时。

O157:H7型大肠杆菌的监测：等分果汁样品在2小时后取回，用0.1%的蛋白胨水进行十进制稀释，接种到胰蛋白大豆琼脂平板和麦康凯山梨醇琼脂平板（一式三份），并在37℃下恒温培养24小时，对获得的O157:H7型大肠杆菌计数。采用薄层琼脂的方法对亚致死损伤的细胞进行恢复^[13]。

物理化学和微生物学分析：果汁样品中的pH值的电势测量用pH计组合电极（贝克曼仪器，富勒顿，加利福尼亚州），AOAC的官方分析方法用于确定果汁样品的总固体含量。用0.1%的蛋白胨水对未接种的果汁样品进行十进制稀释，对好氧嗜温细菌、酵母菌和霉菌计数。将样品在4℃、8℃和28℃孵育10小时，并等分（2小时后取回）重复均匀涂布于胰蛋白大豆和马铃薯葡萄糖琼脂，分别在35℃孵育24小时和在30℃孵育4天。

统计分析：进行两次重复实验。O157:H7型大肠杆菌计数采用SAS的一般线性模型程序进行方差分析。在确定每个变量之间的差异和对四个变量之间的相互作用进行了测试之后，统计学意义水平定位Plt;0.05。

1. 实验结果

毫无疑问，实验室制备的混合物没有检测出致病菌或指标微生物。新鲜制备的胡萝卜-金诺橘混合物的pH值为3.18plusmn;0.15并略有增加（8小时后为3.8）；在28℃下孵育8小时的果汁样品的总固体含量没有显著改变（11.5plusmn;0.46）。直到实验结束，在4℃下，所有样品中的O157:H7型大肠杆菌数（最初4.8log CFU/ml）下降了1.1log CFU/ml，而在8℃下下降更为显著，达到1.35log CFU/ml。在4℃和8℃的冷藏下，未经处理的样品中O157:H7型大肠杆菌数量保持不变。在28℃下，所有样品中的O157:H7型大肠杆菌数下降了1.5log CFU/ml，在28℃下未经处理的样品中，O157:H7型大肠杆菌数量增加（Plt;0.05），并在6小时后达到了8.8log CFU/ml的最高值（2倍增长），直至产物破坏，没有观察到数量进一步增加（10h）（图1）。在恢复受伤的O157:H7型大肠杆菌的过程中，薄层琼脂方法同TSA一样有效。这种方法对受伤细胞进行选择和复苏，从而可以对特定病原体的亚致死损伤（通过热、有机酸、抗微生物剂）的细胞计数。未接种样品中的嗜温细菌计数（图2）为5.5log CFU/ml，而酵母菌和霉菌为6.9log CFU/ml（图3）。在处理的样品中，嗜温需氧细菌显示下降达1.7log CFU/ml，而酵母菌和霉菌仅观察到1log CFU/ml的减少。

1. 讨论

胡萝卜-金诺橘混合果汁作为一种独特的鲜榨果蔬汁组合，以其营养健康、美味廉价的优点，在市场和酒吧中越来越受到追捧。我们研究的目的旨在确定在这种未经高温消毒的流行饮品中，在消耗肉桂的一段时间内其对O157:H7型大肠杆菌的失活作用。几位作者已经研究了植物精油的抗微生物活性，并发现肉桂对抗病原体如沙门氏菌和大肠杆菌具有良好的抑制效果。不出预料，在本实验中，杀伤作用在室温下更为明显，因为微生物的代谢活性在该温度下更为活跃，而在冷藏温度下，这些反应想对变慢，因此生长率和死亡率较低。在不同储存温度下，酸性食品和饮料中O157:H7型大肠杆菌的生存和生长能力已经记录归档^[14]。

水果和蔬菜在生长或收获、处理、洗涤/清洗、加工、配送、零售、制备和最终使用期间易受O157:H7型大肠杆菌的污染^[15][16][17]。污染可能是由于在水果和蔬菜收获前使用处理不当的粪便作为肥料。由于大肠杆菌由反刍动物积蓄，并且在粪便中存活时间比在动物活体内更长，不当堆肥牛粪可能是这种病菌传播的重要来源，尤其是在生产如萝卜、胡萝卜和绿叶蔬菜时^[18][19]。至少有两次O157:H7型大肠杆菌疾病的爆发可以追溯到是因为有机种植者使用含大肠杆菌的粪便进行生产^[20]。此外，最近对施加了含O157:H7型大肠杆菌的牛粪的土壤对胡萝卜影响的研究表明，这种病原体在胡萝卜上的高细胞数可以维持超过10周^[21]。在印度，牛粪被作为肥料广泛运用于农业生产中（没有安全堆肥生产的相关规定）。O157:H7型大肠杆菌从有牛粪的土壤中传入胡萝卜中可能是这种病菌在未经高温消毒的鲜榨胡萝卜汁或胡萝卜-金诺橘混合果汁中传输的关键点。实际上，从农场到摊贩的传输过程中缺乏筛选和卫生习惯可能有利于O157:H7型大肠杆菌进入到果汁中。我们的研究结果表明，未经高温消毒的鲜榨胡萝卜-金诺橘混合物在冷藏温度下为O157:H7型大肠杆菌的存活提供支持，并且在28℃的储存温度下，O157:H7型大肠杆菌可以在其中生长，从而对消费者的构成风险。由于预期的污染的实际水平可能比在实验中模拟的水平更低，在混合物中加入0.3%水平的肉桂提取物可以对产品提供实质性的保护。除此之外，观察到固有菌群中好氧嗜温菌普遍下降，酵母菌、霉菌的数量也有所下降。由于好氧嗜温菌和酵母菌、霉菌一起在腐败中起重要作用，故肉桂提取物在减少其数量和延长保质期方面的贡献十分重要，需要更多必要研究。我们最初的研究是希望进一步发展胡萝卜-金诺橘饮料；然而在产品商业化之前，经肉桂改良的饮料需要接受感官检验。

1. 鸣谢

作者要感谢该工程和技术研究所的主任帕蒂亚拉提供足够的基础设施和财政支持。

1. 参考文献

[1]Zaika LL (1998) Spices and herbs: their antimicrobial activity and determination. J. Food Saf 997–118

[2]Cheng HY, Yang HY amp; Chou CC (2002) Infl uence of acid adaptation on the tolerance of Escherichia coli O157:H7 to some subsequent stresses. J Food Prot 65 (2):260–265

[3]Besser RE, Let SM, Weber JT, Doyle MP amp; Barrett TJ et al (1993) An outbreak of diarrhea and hemolytic uremic syndrome from Escherichia coli O157:H7 in fresh-pressed apple cider. J Am Med Assoc 269:2217–2220

[4](CDC) Centers for Diseases Control and Prevention. Outbreak of Escherichia coli O157:H7 infections associated with drinking unpasteurized commercial apple Juice-British Columbia, California, Colorado, and Washington (1996) Morbid Mortal Wkly Rep, 45:975

[5](CDC) Centers for Diseases Control and Prevention. Outbreak of Escherichia coli O157:H7 infection and cryptosporidiosis associated with drinking unpasteurized apple cider Connecticut and New York, October, 1996 (1997) Morbid Mortal Wkly Rep, 464–468

[6](WHO) World Health Organization. (2001).Global food safety Agenda and health. Report and draft of the secretariat,resolution: WHA 53.15, Geneva

[7]Gupta S, Soni, NK, Kaur P amp; Sood DK (1992) Verocytopathic activity of Escherichia coli O157 and other lsquo;Orsquo; serogroups isolated from patients of diarrhoea. Ind J Med Res 95:71–76

[8]Singh BR, Kulshreshta SB amp; Kapoor KN (1996) An orange juice outbreak due to enterotoxigenic

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