天然多酚缓解脂质过氧化反应引起的对BSA的修饰

关键词：

脂质过氧化反应，多酚，蛋白质修饰，抗氧化

摘要

本实验研究在金属催化氧化的影响下通过多不饱和脂肪酸对牛血清蛋白BSA

的修饰。我们发现孵化BSA和PUFAs72小时导致了高分子量蛋白和脂褐素状荧光

物质的形成以及蛋白质糖基化。天然多酚类物质的应用（根皮素，表儿茶素，槲

皮素，柚皮素）可有效的阻断这些在蛋白质上不同程度的不良影响。由于众所周

知天然多酚类物质具有延迟脂质过氧化的抗氧化剂能力，所以可进一步检查其自

由基之间的相关性活动清除脂质过氧化诱导的BSA修饰能力。一个与其相关性差

的发现说明多酚的抗氧化作用不是参与唯一机制的。因此，可以合理地表明，一

些替代机制如活性羰物种（RCS）-scavenging酚的能力化合物可能会协同工作，

以防止脂质过氧化诱导的蛋白质与人类疾病。

1．导言

膳食脂质大多来自于肉、油和乳制品，这些食物中含有大量的天然饱和的和不饱和的脂肪酸(Benatti, Peluso, Nicolai, amp; Calvani, 2004)。然而饱和脂肪酸的摄取代表着心血管疾病的一个危险因素，多不饱和脂肪酸（PUFAs）的消耗可能对人体的影响有益(Benatti et al., 2004)。有些食物是多不饱和脂肪酸的丰富来源。比如，深海鱼油通常富含二十碳五烯酸（EPA，20：5 n-3），二十二碳六烯酸（DHA，22：6 n-3）；植物油被视为亚油酸（LA，18：2 n-6）和alpha;-亚麻酸（ALA，18：3 n-3）的一个主要来源；花生四烯酸（AA，20：4的n-6）是通常存在于动物类食品中的磷脂。

伴随掺入一个严重的问题即食品中的PUFA的过氧化反应是负责食品风味的变化、颜色、质地和营养价值的一个重要降解过程。目前普遍认为膳食多不饱和脂肪酸的过氧化反应会导致产生一些化学活性化合物，包括自由基、脂氢过氧化物和活性羰基物质（RCS），这些产物将进一步与不同的食物成分相互作用，特别是与蛋白质结合形成一些有毒物质(Kubow, 1992; Tsai, Szweda, Vinogradova, amp; Szweda, 1998)。已有充足的证据表明脂质过氧化衍生的中间产物以及所得的修饰的蛋白质对人类健康无论是在体外和体内具有很大的危害性(Burcham, Kaminskas, Fontaine, Petersen, amp; Pyke, 2002;Williams et al., 1999)。

多酚是一类重要的膳食抗氧化剂，它们用作食品添加剂和营养补充剂受到越来越多的关注，这主要是由于其强大的抗氧化能力(Augustin et al., 2011; Pazos,Alonso, Sanchez, amp; Medina, 2008)。然而，有关酚类化合物能防止脂质蛋白

过氧化源性损害及哪些类型的多酚可以提供更好的保护活动却鲜为人知。在本研究中，一个化学模型体系含有脂肪酸，多酚和经常使用的模型蛋白BSA被用来解开对抗脂质多酚的保护机制过氧化诱导的蛋白修饰。在不同的水果和蔬菜四种多酚，被选中的包括根皮素，外延儿茶素，柚皮素，槲皮素。通过SDS-PAGE（SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳）检测高分子量蛋白的出现、丙二醛的测定（MDA）相关的荧光物质和蛋白质羰基的免疫印迹分析水平进行监测它们对蛋白修饰的影响要研究其抗氧化能力是否与它们抵抗对BSA修饰的保护能力有关，需要两个标准的抗氧化能力试验（水溶性维生素E当量抗氧化能力测定和beta;-胡萝卜素的漂白

测定）进行。

2.材料与方法

2.1 材料

表儿茶素，柚皮素，根皮素，槲皮素，（plusmn;）-alpha;-生育酚，钾过氧二，6-羟基-2,5,7,8- tetramethylchroman-2-羧酸（Trolox的），2,2-连氮基 - 双（3-乙基-6-磺酸）（ABTS），beta;-胡萝卜素，AA，ALA，LA，DHA鱼油从油鲱，吐温80，吐温20，牛血清白蛋白（BSA），氯仿，二甲亚砜（DMSO），亮蓝G250，磷酸盐缓冲液（PBS，0.01M，pH为7.4），L-抗坏血酸，七水硫酸亚铁，和三氯乙酸均购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO, USA)。 OxyBlot^TM蛋白质氧化检测试剂盒自Cell Biolabs公司(San Diego, CA,USA)获得。

2.2含有脂肪酸和多酚类的BSA的孵化

BSA（1毫克/毫升）培养在含有不同多不饱和脂肪酸（LA，ALA，AA，DHA和鱼油）1mM的溶液的PBS（0.01M，pH 7.4）中并加0.2％（吐温20 W/ V）作为乳化剂在37^oC 3天。脂质过氧化反应是由催化剂硫酸亚铁（5 mu;M）和抗坏血酸（100 mu;M）的组合引起的。每20微升多酚（预溶解在DMSO与浓度每50毫摩尔）加入到该反应体系中，以评估其抵抗脂质过氧化诱导蛋白修饰的保护作用。

2.3蛋白修饰的SDS-PAGE分析

孵化后，将反应混合物稀释，5：1（V/V）有2个为mu;L样品缓冲液。将含10mu;g蛋白质等分然后分离于12.5％丙烯酰胺凝胶。蛋白质通过考马斯亮蓝修饰其特征染色。

2.4脂褐素样荧光形成的测定

该实验是根据Kang,Li和Yin（2006）的方法进行一些修改后进行的。孵化后，取用0.5mL的反应溶液，加入等量的20%三氯乙酸，沉淀，离心（1700rpm，10min），洗涤蛋白质沉淀以去除不必要的干扰。蛋白质沉淀物洗净然后重新溶解在PBS中的荧光读取之前由日立F-2500荧光光谱仪（日本，东京，日立公司），用荧光分光光度计监测发射波长395nm，激发波长460nm下的读数。

2.5蛋白质羰基的免疫印迹分析

使用OxyBlot^TM 蛋白氧化检测试剂盒检测共孵育的不同脂肪酸诱导的在BSA上的羰基水平。首先，通过加入等体积的12％的SDS到蛋白质样品将其最终浓度变为6％的SDS。然后衍生化过程通过在室温下加1DNPH（2,4-二硝基苯肼）溶液至样本中15分钟并且通过加入中和溶液终止。衍生化后，加入样品缓冲液混合并装载到12.5％聚丙烯酰胺凝胶。接下来电泳分析，将凝胶转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。通过加入5％（W/V）非脂乳的TBST（Tris-缓冲盐水（pH 7.4）

含有0.1％Tween-20）并晃动可阻止非特异性结合。然后将膜与主培养兔抗DNP抗体（1：150），在室温下1小时然后二级山羊抗兔IgG（HRP缀合）抗体（1：300），1小时。最后，条带由展示台喷雾和灼热ECL印迹检测系统在生物麦克斯X光片上开发。

2.6多酚Trolox的等效抗氧化能力（TEAC）分析

该实验是根据Re（1999）等人的方法进行一些小的修改后进行的。简单地说，首先7mM ABTS盐溶液与过二硫酸钾反应溶液（终浓度：2.45 mM）。于室温、避光的条件下，静置过夜至少16小时，并在2天内使用。在使用前需用纯水将其稀释成ABTS 自由基工作液，其要求是734nm波长下，吸光度为0.70plusmn;0.05。所有的实验中多酚预先溶解于DMSO中。各样品溶液（终浓度：0.05mM）或标准（不同浓度水溶性维生素E）的用稀ABTS自由基混合溶液和吸光度6分钟后采取734纳米上的UV-1206分光光度计（日本，京都，岛津制作所）孵化。结果表示为TEAC值（mM Trolox的/毫摩尔酚类化合物）与一式三份分析。

2.7多酚beta;-胡萝卜素漂白法

该实验在根据先前报道(El-Massry, El-Ghorab, Shaaban, amp;Shibamoto, 2009)进行一些小的修改后在一种beta;-胡萝卜素/亚油酸系统进行的。简单地说，取1mgbeta;-胡萝卜素溶于1ml氯仿中，在加入40mu;l 亚油酸和400mu;l的Tween 80（乳化剂），并放置在一个圆底烧瓶中。然后氯仿除去用氮气流。随后，通过加入100毫升的蒸馏水而得到的稳定的乳液水慢慢将烧瓶中并搅拌残余物。将等份4.5mL的乳液转移到一个10mL的试管，然后加入500mu;L适当稀释茶多酚（终浓度：0.25mMol）。

然后放入50℃水浴锅中，之后在20, 40,60,80,100,120 min的时候测一次吸光度。空白样品的制备是加入500毫升蒸馏水，以控制反应混合物。所述样品beta;-胡萝卜素褪色抑制的百分比的计算如下：

A⁰_S-A⁰⁰_S

%抑制=100 1- ————

A⁰_C-A⁰⁰_C

其中，A⁰_S是样品在0分钟时的吸光度，A⁰_C 是控制在0分钟时的吸光度，A⁰⁰_S和A⁰⁰_C分别是稳定状态下样品和控制的吸光度。

2.8统计分析

通过SPSS统计包进行统计分析(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)，配对样本t检验用于确定是否有一个显著差异（P lt;0.05）与相应的对照相比。

3.结果与讨论

天然多酚抗氧化剂的应用是作为延缓脂质过氧化新兴的战略之一并避免其有害影响(Jacobsen, Let,Nielsen, amp; Meyer, 2008; Lourenco, Gago, Barbosa, de Freitas,amp; Laranjinha, 2008)。天然多酚类抗氧化剂可以提供稳定的化学抗氧化性以降解脂类因此减小了蛋白质修饰的形成，并可能改进食品的营养和感官品质，以及对人们健康有益(Kuffa, Priesbe, Krueger, Reed, amp; Richards, 2009)。然而，目前还不太了解除了抗氧化活性酚化合物的其它性能是否可以促成它们抵抗脂质过氧化作用引起的蛋白质修饰。

在本研究中，化学模型体系的建立是为了测试多酚对多不饱和脂肪酸过氧化诱导蛋白修饰的影响。首先在抗坏血酸氧化稳定性/ O 2/铁（Ⅱ）金属催化氧化系统将ALA、AA、DHA和鱼油混合物的氧化稳定性进行比较。值得注意的是，对于不同PUFA来说BSA（67 kDa）的曝光都可导致高分子量形成蛋白。在他们的研究中，其反应体系与我们类似，只是他们使用的脂肪酸是多不饱和脂肪酸酯。他们的结果表明在SDS-PAGE存在两个额外频带，通过二维电泳确定其中一条带的分子量约为71.5 kDa并且通过基质辅助激光解吸和电离质谱（MALDI-MS）分析另外一个条带的分子量约为93 kDa。此外，他们发现因为脂肪酸的不饱和度增加高分子量蛋白的形成得到加强。该排序可概括为亚油酸甲酯lt;亚油酸甲酯lt;甲基花生四烯酸lt;甲基十二碳六烯酸。我们的结果与其相似的，而且我们还发现，该BSA的修饰是通过鱼油混合物显然由纯DHA呈现而引起的。

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