高效液相色谱---串联质谱法测定医用聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺的残留量

原文作者：Wei-WeiLi,HuiLi,and QunQiao1

摘要：目标 利用高效液相色谱---串联质谱的方法测量医用聚丙烯胺水凝胶中丙烯酰胺的残留量（HPLC-MS）。方法 在加入13C3标记的丙烯酰胺后，样品从水中提取，再利用硅藻土进行清理。聚丙烯酰胺水凝胶样本和20个临床案例通过HPLC—MS/MS进行分析并且利用同位素稀释量化技术进行反应检测（SRM）。结果 丙烯酰胺会从聚丙酰胺水凝胶中分离出来。丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺的浓度在20个临床案例中从3.9x10^-9g/L变成3.1x10^-8g/L.峰面积呈现良好的线性图且范围会达到3000ug/L.此项实验的回复速率达到103.1%。期间，标志性水平是50ug/L，相对标准误差（RSD）是6.20%。

结论：HPLC---MS对于测量医用聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺的残留量是一种快速、精确而又敏感的测试方法。

关键词：高效液相色谱—串联质谱法；聚丙烯酰胺水凝胶；丙烯酰胺

引言：

医用聚丙烯酰胺水凝胶（PLHG），一种可控分子量的聚合物，通过聚丙烯酰胺单体聚合（AM）作用而成。它被作为医用材料或永久填充物广泛应用于食物、水供应以及冶炼行业。在乌克兰和俄罗斯使用时长已超过15年，而在中国和东欧国家已使用长达9年之久。2006年，中国国家食品药品管理局禁止使用该物质。在中国，大约有300,000患者经历整形外科手术，大多数人是为了隆胸接受该药物注射。然而，一个令人担忧的问题被广泛地议论。聚丙烯酰胺单体过去常用来生产聚丙烯胺水凝胶，但同时它又是一种潜在的诱导有机体突变以及再生有毒物的物质。这种凝胶很显然粘性很好，但在操作过程中，从注射部位取出后，它就变成淡黄色，粘度变低并伴有颗粒。因此，我们有必要研究清楚医用聚丙烯酰胺水凝胶中残留量单体的毒性。因为在制造过程中残留量毒物不能够完全不能够完全避免，而且这种凝胶的稳定性在人体内尚未清楚。

现在已经有一些方法来进行AM的测定了，例如，光谱学法和高效液相色谱仪。然而，大多数方法并不是很精确，因为存在些潜在的干扰因素。在这篇论文中，我们将呈现一种简单而有效的方法来测定AM，尤其是测定PAHG。这种 方法对AM的测定精准度缩小至10亿分之几的范围。我们从20个病人体内提取AM，这20个人为了隆胸注射了PAHG。通过利用高效液相色谱---串联质谱的方法进行测定，结果证明，这种方法能够精确地测量PAHG中的AM（HPLC-MS）。

材料和方法

试剂和化学品：

聚丙烯酰胺单体AM（gt;99.8%,适用于电泳，丙烯酰胺）；¹³C₃标签的AM；甲醇；超纯水；甲酸；乙烷；乙烷基；硫酸铵；硫酸钠；工业氮气；超纯氮；液氮；硅藻土；

PAHG的样本取自于2007年接受PAHG注射的20名女性，标准的样本凝胶。

设备：HPLC系统和MS设备。HPLC—MS的接口在LTQ线性离子阱质谱仪上，以此获得HPLC—MC数据。在MG120C18上实行HPLC的分离。此分离需要10ul样品量、26C烘箱温度以及甲醇、0.1%的甲酸流动相在每分钟0.6ml的流动速率下进行。这类质谱会在全扫描模式下进行。检测极限值和数量通过反应监控实行。另外还会包括，阳离子气压化学离子化，放电电流5uA, 300C的离子传输管温度，30Arb的流气，10Arb的辅助气体，5伏电压下进行碰撞诱导解离，0.5的激活Q，40%的碰撞能量。其他设备还包括粉碎器、旋转式汽化器、氮浓缩器、振荡器、水净化器、电子分析天平、玻璃层析柱、漩涡振荡器。

步骤：在10ml的甲醇溶液中溶解10ml标准单体获得一杯标准储备AM溶液（1000ug/L）,并存储在零下20C。在同样的温度下，储存一份从9ml甲醇溶液中稀释出的1.00ml原液。再从9ml含0.1%的甲酸溶液中稀释1ml溶液作为储备原液I号。从9ml含0.1%的甲酸溶液中稀释1ml的原液I号出来作为原液II号。

在10ml的甲醇溶液中溶解10mg ¹³C₃---AM标准单体原液一份，储存在零下20度温度下。同样温度下，储存一份原液II号，此溶液从99ml的甲醇溶液中溶解1ml¹³C₃—AM标准溶液I号而得。再从99ml的0.1%甲醇溶液中溶解1.00ml原液II号，一样的温度下储存。

两克的PAHG样本浸泡在带有¹³C₃-AM的纯净水中（10ml），在400rpm下，振荡30min,分离10min,然后保留上层清液。

上层清液和8g硫酸铵混合，在4000rpm下振荡且分离10min.10g的上层清液保留继续使用。10g的无水硫酸钠和2g的硅藻土放入一个干净点的玻璃层析柱中。然后，5g的硅藻土和样本上清液原液混合放入层析柱中，在60ml的乙烷里以2ml/L的速率进行洗脱，在60ml的乙酸乙酯里同样以2ml/L的速率进行再次洗脱。乙酸乙酯的洗提物搜集起来，在45度的水浴中汽化3次。之后，样本原液和1ml的0.1%甲酸进行混合和振荡。1ml的乙烷加入后，它在5min 3500rpm下进行振荡和分离。在底层水相中用0.23um滤膜过滤，然后用HPLC—MS进行测量。

样本溶液和标准溶液被注入HPLC—MS/MS系统中，AM和¹³C₃—AM的峰面积会被记录，并计算AM和¹³C₃—AM的峰面积速率。标准溶液的样本数量变化以及AM和¹³C₃—AM的峰面积绘制在直线图中。

样本中的AM含量通过以下公式计算：Xn=

在以上公式中，Ms 表示¹³C₃—AM的样本含量。An是目标峰面积，As是¹³C₃—AM速率峰面积，M是样本容量。相对反应因子通过以下因素计算：

An是目标峰面积，Cn是目标物含量，As是¹³C₃—AM速率峰面积，Cs是¹³C₃—AM速率含量。

精确值通过恢复率和相对标准误差进行评估。恢复速率是指对样本以及标准溶液的反应速率。

结果：线性方程是y=165.22x-2.2547.相关系数是0.9983.此实验是直线型图在0—300ug/L之间，适合用于测量医用PAHG中AM含量。医用PAHG样本在提取和净化之后，通过HPLC—MS/MS获得质谱。AM的保留时间会有一个明显的分界线，在此期间有一个干扰峰值。目标物的峰形是陡峭而匀称的。在20个临床案例中，PAHG中AM含量从3.9x10^-9到3.1x10^-8变化。这个结果低于ISO质量标准和国际医疗设备生物评价标准。相对标准误差计算接近6.20%，用区间数据算得，而此数据来自于50ug/L的浓度比率。恢复率是103.1%。

讨论：紫外线分光光度法、气相色谱分析、液相色谱法都层用来测试AM，但是结果都令人不太满意。这些方法都有高度检测极限和干扰性因素，会严重影响结果。AM无法通过这些方法精确测出。

高效液相色谱法包含高压泵和高敏度检测器配置，高效、快速。几乎所有化合物包含高极性、离子物、高分子物质都可以通过高效液相色谱法测量。一些研究人员通常使用高效液相色谱法测量食物和水中的AM含量。尽管高效液相色谱法具有良好的重现性，但是相比HPLC—MS还是有些局限性。

HPLC—MS是一个高效分离系统，可用于多种混合物数量与质量的测量。它还能够检测出复合物的分子重量和结构信息。HPLC—MS能分析水样本并且对分析者无害。它的样本准备非常简单。在2002年的7月，WHO和FAO授权发布GC—MS和LC—MS。美国食品与药品监管局在2003年2月，发布一篇文献关于食物中AM的数量检测。结果表明，HPLC—MS对于检测AM在医用PAHG中含量更为简单。

在AM的保留时间之前，干扰峰值的原因还不清楚。这个干扰峰值有明显的分界线。在PAHG的标准检测中是没有干扰峰值的。是否此样品被血液或其它尚未清楚的人体内PAHG的分解物所污染还是个谜。对人体内血清来说，没有一个很好的样品储备。血液中的物质干扰不能够被排除。对于注射过PAHG的病人来说，外科手术是去除凝胶的最好方式。

在自然界中，PAHG（热、水解、氧化作用、催化氧化、生物催化）分解成低聚物是很慢的。比如，AM直接或间接地毁坏人的身体。我们也不能排除PAHG可能会在人体内分解成可替代化合物而不是AM。这个化合物可能会改变内在环境，比如ph值，可能会导致肌肉疼痛和其他并发症。一旦分解发生，对人体的损害是不可避免的。WHO认为水中的AM量是1ug/L。XI曾认为AM在PAHG中的浓度低于1.00x10g/ml是没有毒性的。在我们的研究中，高效液相色谱法中的浓度是14.39 6.4x10g/l。这表明，AM在医用PAHG中属于正常值范围。仍有报告表明，凝胶中AM的残留量低于1.10x10^-6g/l,而且6个月后低于1.3x10^-9g/L。这与我们的研究结果一致。因此，对于检测医用PAHG中AM的含量，HPLC—MS是一个更简单的方法。

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 4 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[286387]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word