稻瘟病菌对唑菌酯的抗性评估及抗性突变基因cyt b的检测

作者：Qin Peng a, 1, Hua Zhao a, 1, Guosen Zhao a, Xuheng Gao a, Jianqiang Miao a,*, Xili Liu a, b,*

单位：a State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Arears, College of Plant Protection, Northwest Aamp;F University, 3 Taicheng Road, Yangling 712100, Shaanxi, China

b Department of Plant Pathology, College of Plant Protection, China Agricultural University, 2 Yuanmingyuan Road, Beijing 100193, China

摘要：唑菌酯是我国开发的一种新型杀菌剂。本研究旨在测定稻瘟病菌对唑菌酯的敏感性，并探讨唑菌酯在稻瘟病菌中的潜在抗性风险和抗性机制。结果表明，109株稻瘟病菌对唑菌酯的平均EC50为0.0094mu;g/mL，敏感性呈单峰分布。基线敏感性可为监测稻田稻瘟病菌对唑菌酯的敏感性变化提供关键数据。经调查通过药剂适应获得的抗性突变体的生物学特性来评估潜在的抗性风险。结果表明，稻瘟病菌对唑菌酯的抗性风险为中到高，唑菌酯和嘧菌酯之间存在正交叉抗性，而唑菌酯与多菌灵、异硫氰酸酯和咪鲜胺之间没有交叉抗性。进一步的研究表明，唑菌酯抗性突变体在cyt b蛋白中有G143S突变。分子对接证实，G143S取代使稻瘟病菌对唑菌酯具有高抗性。总的来说，本研究结果为监测抗药性的出现和制定唑菌酯的抗药性管理策略提供了必要的数据。

关键词：稻瘟病菌； 唑菌酯； 抗药性风险；细胞色素b蛋白；点突变； 分子对接

1.导言

稻瘟病由稻瘟病菌引起的，它被认为是水稻最重要的真菌病害之一和最具破坏性的病害。它导致水稻产量平均每年减少10%至30%，病害严重情况下产量减少40%至50%甚至绝收。我国水稻叶瘟发生面积88万公顷，同比增长10.7%；2019年主要集中在东北稻区的穗颈瘟发生面积超过30万公顷，同比增长44.3%。抗稻瘟病品种的培育、转基因技术、生物防治和化学防治已应用于控制稻瘟病。然而，在目前水稻抗稻瘟病育种的背景下，很少有抗苗瘟和穗瘟的抗性（R）基因可用，而且并非所有R基因都能保护所有稻瘟病小种。稻瘟病的生物防治是一种理想、低成本和环境友好的方法，但其有效性尚未通过大规模、长期的田间试验得到证明。由于担心转基因水稻的安全性，转基因水稻一直备受争议。化学防治是目前广泛应用的稻瘟病防治措施。据最新统计，我国已登记的防治稻瘟病的杀菌剂产品有981种，主要活性成分包括多菌灵、咪鲜胺、异硫氰酸、三环唑、非诺克斯苯胺、甲基托布津、唑菌酯、戊唑醇、吡唑菌素、卡苏霉素和丙环唑。尽管在中国检测到一些抗异硫烷或多菌灵的稻瘟霉素，但来自中国几个水稻种植区的大多数稻瘟菌种群仍然对异硫烷、三环唑、戊唑醇、咪鲜胺和吡咯菌素敏感。因此，黑色素生物合成抑制剂（MBI）、去甲基化抑制剂（DMI）和醌外抑制剂（QOI）在中国仍然可以有效控制稻瘟病。

唑菌酯或甲基（E）-2-（2-（（3-（4-氯苯基）-1-甲基-1H-吡唑-5-氧基）甲基）苯基）-3-甲氧基丙烯酸酯，是沈阳中化农药研发中心开发的一种新型QoI杀真菌剂。。迄今为止，只有一种产品——唑菌酯和氟吗啉的混合物，已在中国注册用于控制人参的黄瓜霜霉病和疫病。然而，唑菌酯还显示出对一系列植物病原菌的特殊功效，包括短孢炭疽菌、黄瓜枝孢菌、番茄灰霉病菌、立枯丝核菌、卡西可乐棒孢菌、黄孢球孢菌、小麦白粉菌、古巴假霜霉和米曲霉。因此，唑菌酯在包括稻瘟病在内的植物病害化学防治方面具有巨大的市场推广和应用潜力。

QoI杀菌剂通过结合线粒体酶细胞色素b（cyt b）的Qo位点阻断线粒体电子传递链中的电子传递，从而抑制真菌呼吸。研究表明，Qol杀菌剂的抗性机制与目标蛋白cyt b中的氨基酸替换有关，如G143A/S、F129L、Y131C和G137R，以及选择性氧化途径中选择性氧化酶基因（AOX）的过度表达以及运输机制。然而，迄今为止，在中国还没有关于植物病原菌对唑菌酯的抗性风险和分子抗性机制的信息。因此，本研究的目的是（i）确定稻瘟病菌对吡咯烷酮的敏感性，（ii）评估对吡咯烷酮的抗性风险，以及（iii）研究稻瘟病菌对吡咯烷酮的抗性机制。

2.材料和方法

2.1.稻瘟病菌分离株对唑菌酯的敏感性

采用菌丝体法测定了我国9个省份109株稻瘟病菌分离株对吡咯烷氧菌酯的体外敏感性。唑菌酯（90%，活性成分）溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，生成1 x 10⁴ug/mL贮备液，该贮备溶液储存在4℃时的黑暗环境中。敏感性试验使用烷基酯琼脂（AEA）进行，该琼脂是使用6 g NaNO₃、5 g酵母提取物、1.5 g KH₂PO₄、0.5 g KCl、0.25 g MgSO4·7H₂0、20 ml甘油、20 g琼脂，然后用蒸馏水定容使体积达到1 L。然后用一系列浓度的吡氧激酶（0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.02或0.04 ug/mL）对AEA培养基进行修正。二甲基亚砜的浓度限制在0.1%（v/v），初步试验中发现该浓度不会抑制生长。为阴性对照添加等量的二甲基亚砜。为了抑制自然呼吸的改变，使用100微克/毫升水杨酸羟肟酸（SHAM）。从5日龄稻瘟病菌菌落的生长边缘切下直径为5mm的菌饼，并转移到AEA平板的中心。在25°C下黑暗培养8天后，垂直测量菌落直径。每个处理重复三次，整个实验进行两次。收集的数据根据Lu等人描述的方法进行线性回归，来估计50%抑制的有效浓度（EC₅₀）。

2.2.稻瘟病菌对唑菌酯抗性突变体的产生

通过在含有不同浓度唑菌酯的AEA培养基上筛选七个野生型稻瘟菌分离株（M001、M027、M044、M073、M120、M151和M198），产生了对唑菌酯具有抗性的稻瘟菌突变体。最初将菌丝塞接种在含有10 ug/mL唑菌酯的AEA培养基上（培养8天后，所有野生型米曲霉分离物都无法生长的浓度），并在25°C下暗培养15天。生长的菌落再次转移到添加了10mu;g/mL唑菌酯的培养基中。在此步骤后，将生长菌落进一步依次转移到用以下浓度吡咯烷酮菌酯修订的培养基中：30、50或80 ug/mL。在多次继代培养后，将存活菌落转移到含有80 ug/mL吡咯烷酮菌酯的AEA琼脂中，进行进一步的三次继代培养。唑菌酯抗性突变体的EC₅₀值是通过在含有唑菌酯系列浓度（0,5,10,20,40,80或120 ug/mL）的AEA琼脂上测量其菌丝生长获得的。为了抑制交替呼吸作用，向所有使用的AEA琼脂中添加100 ug/mLSHAM。通过将突变体的EC₅₀除以相应野生型亲本分离物的EC₅₀，来计算每个抗性突变体的抗性因子（RF）。

2.3. 稻瘟霉素抗性突变体的表型

2.3.1. 唑菌酯抗性的稳定性

在无杀菌剂AEA培养基上连续传代10轮后，通过比较第1代和第10代的EC₅₀，测定了抗唑菌酯突变体的稳定性。还对相应的野生型亲本菌株进行了评估，以进行比较。如上所述，测定第1代和第10代培养物的EC₅₀值和RFs。敏感性变化因子（FSC）通过将第10代培养物的RFs除以第一代培养物的RFs来计算。每种处理重复三次。

2.3.2.菌丝生长

在25°C的无杀菌剂AEA培养基上评估吡咯烷氧酯抗性突变体及其相应野生型亲本菌株的菌丝生长。黑暗培养8天后垂直测量菌落直径。每一个处理重复三次，整个实验进行两次。

2.3.3. 孢子形成与分生孢子萌发

分生孢子是根据之前的报告产生的。简而言之就是在25°C条件下，在杀菌剂无燕麦番茄琼脂（OTA）培养基（40克燕麦、20克琼脂、150毫升番茄汁和蒸馏水，定容到1升）上暗培养唑菌酯抗性突变体及其相应的亲本菌株七天。经过五天的黑光灯处理后，用无菌湿棉签去除气生菌丝生长。分生孢子是通过用5毫升无菌水浸泡菌落，并用玻璃细胞撒布器轻轻地涂在菌落表面而获得的。分生孢子的数量用血细胞仪定量，以估计每平方厘米培养物中分生孢子的数量。在25°C的黑暗中培养24小时后，在光学显微镜下估计每一粒孢子的萌发率。每一个处理重复三次，整个实验进行两次。

2.3.4.致病性测定

利用稻瘟病菌对水稻叶片的侵染试验，测定了抗唑菌酯突变体及其相应亲本菌株的致病性。将30 mL米曲霉分生孢子悬浮液（5 times; 10⁵分生孢子/mL）喷洒在含有100株五叶水稻植株（品种春优T39）的盆栽上。接种的水稻植株在24℃黑暗中培养48小时，然后在26℃下培养12小时，光照周期为5天。根据0-9量表法评估疾病严重程度，并通过以下公式计算：疾病严重程度=（[疾病量表times;具有单独疾病量表的植物数量]/[最大疾病量表x调查的植物总数]）times;100。每个处理包括50株水稻，整个试验进行两次。

2.4.交叉抗性分析

使用上述菌丝体分析法评估了7个唑菌酯抗性突变体和7个野生型菌株对4种属于不同化学组的杀真菌剂的敏感性，这些杀真菌剂包括偶氮菌酯、多菌灵、异硫氰酸酯和氯霉素原。每种杀菌剂的浓度已在补充表S1中列出。通过Spearman秩相关法进一步分析唑菌酯和四种受试杀菌剂之间的交叉抗性。

2.5.cyt b基因的序列分析

使用先前研究（Doyle和Doyle，1987）中描述的CTAB方法，从吡咯烷氧酯抗性突变体及其相应的亲本菌株中提取总基因组DNA。一个879 bp的cyt b基因部分序列（核苷酸位置163-1041，氨基酸位置55-347），包含所有报告的QoI杀菌剂抗性相关突变位点，使用EasyTaq DNA聚合酶（北京转基因生物技术有限公司）和两个报告的引物cytb-F:5-AGTCTAGTTAATGGAAGC-3和cytb-R:5-ATCTTCAACGTTAGACC-3进行扩增（Miao等人，2020年）。PCR过程如下：在95℃下初始变性5分钟，然后在95℃下进行35次变性循环30秒，在60℃下退火30秒，在72℃下延伸1分钟，最后在72℃下延伸10分钟。PCR产物由中国上海桑贡生物技术有限公司测序。使用带有默认参数的DNAMAN（版本7）和SnapGene（版本1.1.3）软件进一步分析序列。

2.6. 分子对接分析

根据之前的一份报告，进行分子对接以验证导致稻瘟菌对唑菌酯抗性的cyt b蛋白中的G143S取代。简言之，利用酿酒酵母（3CX5）中cyt b蛋白的晶体结构作为模板，研究了吡咯烷氧基strobin与米曲霉cyt b蛋白之间的结合构象。根据SYBYL X 1.2软件包中的3CX5模板和管弦子集，获得了米曲霉cyt b蛋白的建模结构。根据五倍子cyt-B蛋白中Qol杀菌剂三氟氧菌酯的3L70a配体模式的晶体结构预测结合腔。通过来自SYBYL X 1.2的生物聚合物替换序列子集对G143S残基进行定点突变。能量最小化由Tripos力场和Gasteiger–Marsili电荷进行。吡咯烷氧酯的分子构象通过草图模式构建，并使用Tripos力场和Gasteiger-Huckel电荷进一步优化。使用SYBYL X 1.2的对接套件进行分子对接建模。总分用于评估配体和蛋白质之间的结合亲和力。分子建模在Silicon GraphicsR（SGI）燃料工作站上进行。根据能量评分和结合方式分析了点突变与杀菌剂亲和力的关系。

2.7.统计分析

菌落直径、孢子形成、发芽率和疾病严重程度的数据通过数据处理系统软件（版本7.05）进行分析，使用单因素方差分析和Duncan多重比较检验（Plt;0.05）。

3.结果

3.1.稻瘟病菌分离株对唑菌酯的敏感性

唑菌酯对109株稻瘟病菌的EC₅₀值范围为0.0015至0.0220 ug/mL。EC₅₀值的频率分布呈单峰曲线，平均EC₅₀为0.0094 g/mL（图1）。此外，结果表明，由于在不同省份的分离物中观察到一系列EC₅₀值，因此敏感性与分离物的地理位置之间没有相关性（表1）。

图1 109株稻瘟病菌分离物唑菌酯EC50值的频率分布。

表1 中国9个省109株稻瘟病菌分离株对吡氧菌素的敏感性。

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