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摘 要

由于开心果具有潜在的保健作用，故近年来开心果消费量显著增加。然而开心果也是一种很重要的食品过敏原，因此有必要建立一种快速检测开心果过敏原的方法。本文是针对开心果的Pis V 1基因所建立的环介导等温扩增技术（LAMP），对开心果有较高的特异性，不能检测出其他坚果类产品。该方法可检测出10 pg以上的开心果基因组,故灵敏度较高。煮沸和高温高压对开心果检测未见影响。同时对不同商品食品检测，研究所用LAMP方法的实用性，结果表明可用于食品中开心果的快速检测。

关键词：过敏原，开心果，环介导等温扩增，检测

Abstract：The consumption of pistachios has increased significantly in recent years due to the potential health care effects of pistachios. However, pistachio is also an important food allergen, so it is necessary to establish a rapid method for detecting pistachio allergen. The loop-mediated isothermal amplification technique (LAMP),) based on Pis V 1 gene of pistachio has high specificity to pistachio, and can not detect other nut products. This method can detect the pistachio genome above 10pg, so the sensitivity is high. Boiling and high temperature and high pressure had no effect on the detection of pistachios. At the same time, the practicability of LAMP method for the detection of different food products was studied. The results showed that the method could be used for the rapid detection of pistachios in food.

Keywords：pistachio, allergen, loop-mediated isothermal amplification, detection

目 录

1 前言…………………………………………………………………………………………3

1.1 过敏原及过敏反应机制………………………………………………………………… 3

1.2 过敏原不同检测方法及对比…………………………………………………………3

1.3 环介导等温扩增原理……………………………………………………………………4

1.4 食品过敏原介绍…………………………………………………………………………… 4

1.5 开心果过敏原反应现状………………………………………………………………… 5

2 实验材料与方法………………………………………………………………… 5

2.1 实验材料………………………………… …………………………………… 5

2.2 实验主要试剂 …………………………………………………………………… 5

2.3 实验主要仪器 ………………………………………………………………… 6

2.4 基因组的提取 …………………………………………………………………… 6

2.5 基因组DNA的纯度和浓度测定…………………………………………………… 7

2.6 开心果Pis V 1编码DNA的克隆、鉴定与测序……………………………… 7

2.7 LAMP检测引物的设计与合成…………………………………………………8

2.8 LAMP反应体系的配制与反应的进行……………………………………… 8

2.9 产物的检测 ……………………………………………………………………… 9

2.10 特异性检测………………………………………………………………………9

2.11 灵敏度分析………………………………………………………………………9

2.12 煮沸处理…………………………………………………………………………9

2.13 高温高压处理………………………………………………………………… 9

2.14 商业化食品的检测…………………………………………………………… 9

3 实验结果与分析……………………………………………………………… 10

3.1 Pis V 1编码DNA的克隆、鉴定与测序结果分析…………………………… 10

3.2 LAMP检测引物的设计与合成结果分析………………………………………… 11

3.3 特异性分析………………………………………………………………………12

3.4 灵敏度分析………………………………………………………………………13

3.5 煮沸处理对检测影响的分析……………………………………………… 13

3.6 高温高压对检测的分析………………………………………………………14

3.7 商业化食品检测分析…………………………………………………………15

4 讨论…………………………………………………………………………………16

5 结论 ……………………………………………………………………………… 19

参考文献………………………………………………………………………………20

致谢……………………………………………………………………………22

1 前言

过敏原是一种外源性蛋白质，过敏原是通俗的叫法，通常被定义为一种能引发人体过敏反应的抗原。不同过敏原的共同特点是机体暴露于过敏原一段时间内产生过敏反应。当人体首次接触过敏物质不发生过敏反应，再次接触到过敏原,过敏反应才会产生，症状通常会随着暴露频率的增加而加重，因此它是一种较高复发率的疾病^[1]。过敏反应产生的机制有以IgE介导和非IgE介导类型，在这两种类型中以IgE介导为主要效应，IgE介导的效应关键是产生IgE抗体以及相应的效应细胞协助，过敏原初次进入人体，IgE抗体和效应细胞形成结合物，当再次进入人体，与初次结合的抗体效应细胞结合物结合，释放出组胺、PG、LTs、PAF等引发过敏反应的物质^[2]。对比IgE介导类型，非IgE介导的食品过敏反应具体机理目前尚不清楚，但研究证明非IgE诱发的过敏反应所需要的过敏原诱发量要比IgE介导的效应要多。为了制止食品过敏现象的产生，通过临床观察或过敏原检测，首先是要确定具体是哪种过敏原，然后去摸察过敏原来自哪里，这样才能够从源头上杜绝过敏原接触人体，从而会避免过敏反应的产生。同时，有些外在因素会使过敏现象加重，比如灰尘、烟等，因而要特别注意。

过敏原检测方法一般可分为过敏蛋白质检测和DNA检测两大类。第一大类针对过敏蛋白的检测，血清学实验就属于基于蛋白质的检测，利用抗原和抗体结合的原理，其中酶联免疫技术是应用最广泛的，从20世纪60年代开发至今，免疫酶技术操作简单方便、灵敏度高，不需要昂过仪器，因这些特点而受到人们的青睐^[3]。市面上针对开心果的ELISA试剂盒已经有80多种，对于蛋白质的整体结构和IgE的结合能力要求较高，但开心果加工过程中蛋白质会受到影响，故该方法不太适用于加工后的开心果检测。经过研究发现，食品中存在着大量不同的蛋白质，有些蛋白质是过敏原，例如谷类、蛋类以及坚果类等^[4]，在日常生活中坚果过敏最为严重也最为常见，成人对这些过敏原发病率较低，但是婴幼儿在食用这些蛋白质后容易发生过敏反应^[5]。而基于DNA的检测，常见的就是PCR扩增方法，该方法属于常规方法，以及近年来应用广泛的LAMP法。PCR在1980年时被开发，是一种在体外，就能扩增体内DNA的技术，该技术的原理是以目标基因组序列为模板，在不同的温度下，经过多次变性一退火一延伸，大量目标DNA分子以接近指数扩增的形式产生，这种技术将DNA的扩增时间缩短到3个小时以下，因而大大提高了扩增效率^［6］。2000年，Notomi等人报道了环介导等温扩增方法 (loop-mediated isothermal amplification，LAMP),针对DNA片段中的6个或8个特殊区域，可获得4个或6个特殊的引物，利用Bst

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