论文总字数：6086字

摘 要

：转基因生物技术的发展日渐成熟，转基因产品给社会带来了巨大的经济效益，但是外源基因对环境的污染以及外源基因表达产物的过敏性及毒性也可能给人类健康带来极大的损害。为确保转基因产品及其衍生品的效益，安全性检测技术应运而生。当前国际上关于转基因产品的安全性检测主要包括基于核酸水平和蛋白水平的检测，本研究以市场上购买的全麦面包为试验材料，根据我国农业部1782号公告-3-2012的检测标准，对其进行定性和定量PCR分析，来检测生产该全麦面包的原材料是否含有外源基因。

关 键 词：全麦面包，外源基因，定性PCR，定量PCR

Abstract: With the development of genetically modified biotechnology, genetically modified products and their derivatives have brought great social and economic benefits to our society. However, the pollution of foreign genes to the environment and the sensitivity and toxicity of foreign gene expression products may also bring great harm to human health. Therefore we need safety testing technology. Usually, based on nucleic acid and protein level to detection foreign gene. For this study, bread are used as experimental materials. According to the Ministry of agriculture of China announced the 1782 -3-2012 testing standards, using qualitative and quantitative PCR analysis, the raw materials for the production of this wheat bread were detected whether there were exogenous genes.

Keywords: wheat bread, foreign gene, Qualitative PCR, Quantitative PCR

目 录

1前言 4

2 材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1材料 5

2.1.2 试剂与耗材 5

2.1.3 仪器设备 6

2.2 实验方法 6

2.2.1抽提样品总DNA 6

2.2.2样品DNA浓度测定 6

2.2.3定性及定量引物与探针 6

2.4.3 PCR检测 6

3结果分析 8

3.1 DNA浓度测定 8

3.2定性检测 8

3.3荧光定量 PCR 检测 9

结论 10

参考文献 11

致谢 13

1 前言

近年来，世界人口剧增，且社会发展使得人们对物质生活的要求越来越高致使粮食危机日趋严重^[1]。通过育种改良作物性状势在必行，而生物科技的发展大大提升了具有效力，同时有效降低了传统育种世界，通过生物技术跨越了物种间遗传物质不相容的亲缘关系界限，实现了作物性状的定性改变和基因的定性转移^[2]，成为近年来的重要育种手段。

小麦在全球范围内的种植面积很大，分别范围也很广，是世界上第二大粮食作物^[3]。但是由于其作为主要食物。早在1992年，Vasil等利用基因工程手段，通过基因枪介导法将抗除草剂基因Bar导入小麦，获得了世界上第一例转基因小麦^[4]，由此打开了小麦生物技术育种的大门，关于小麦遗传育种的重心主要集中在小麦性状提升方面。如德国艾格福公司研发的抗草铵膦除草剂转基小麦^[5,6]以及美国孟山督公司的转抗草甘膦(RoundupReady Wheat)基因小麦等都不同程度的提升了小麦品质。

目前，关于转基因生物外源基因对环境的影响受到广泛关注，而转基因生物的衍生产品的健康问题也是大家关注的焦点。近年来，关于转基因检测的报道较多，例如：许爽等使用定性PCR技术对含有卡纳霉素的8个番茄品种进行转基因检测^[7,8]，近年来，日益完善的转基因检测技术和安全性标准的不断规范为外源基因的检测和受体植物的研究提供了更多的可靠理论依据^[9]。

Bar基因是目前使用最多的抗除草剂基因，大部分都用于大豆、玉米、小麦等作物外源基因的筛选标记。PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称^[10-12]，利用DNA聚合酶在体外完成DNA的复制，利用该方法可以有效的检测目标生物体的外源标记基因^[13]，本研究使用全麦面包为研究对象，采用优化后的CTAB法抽提供试全麦面包基因组总DNA，获得的DNA使用Nano Drop测定其浓度和纯度，在DNA品质达标的情况下用作模板进行外源抗基因Bar的检测，并通过实时荧光定量对实验结果进行进一步的验证。

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1材料

本研究选取的是已经商业化的没有明确标识的全麦面包（共6种），购自淮安市淮阴区苏果超市，实验室标号为1-6。

2.1.2 试剂与耗材

实验所用dNTPs(2.5 mM)、Taq酶(5 U/μL)及DNA Marker购自北京佳兰生物公司、用于电泳的DNA ladder maker购自康为世纪公司。委托上海捷瑞生物工程公司合成定性引物、定量引物和探针。

2.1.3 仪器设备

PCR仪、DYY-6D 电泳仪、FR-900 凝胶成像仪、EQ2033微型旋涡混合器、DELTA320 pH计、核酸微量分析仪（Nano Drop）、单道可调移液器。

2.2 实验方法

2.2.1 抽提面包总DNA

本研究抽提浮萍基因组总DNA采用改进的CTAB法^[14]。

2.2.2 DNA浓度测定

使用Nano Drop将获得的基因组总DNA进行分析，测定通过该方法获得的DNA是否能够用于定性和定量PCR分析。

2.2.3定性及定量引物与探针

由于目前我们的转基因农作物研究较为迅速，针对转基因小麦的检测体系也较为成熟，因此在检测供试全麦面包时，可以直接根据农业部发布的检测标准进行，具体引物和探针序列详见表1和表2。

2.4.3 PCR检测

目前关于转基因产品的检测主要是基于核酸和蛋白的检测，在粉碎小麦加工成面粉的过程中，大量的基因组DNA被破坏，因此使用外源基因蛋白检测的假阴性概论较高，为了更加精准的检测目标全麦面包，本实验采用定性和定量PCR进行外源Bar检测。

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