文 献 综 述

糖苷酶又名糖苷水解酶，是一类催化各种含糖化合物中的糖苷键水解生成单糖、寡糖或糖苷类复合物的酶^[15]。糖苷类化合物是自然界中一类重要的化合物,其在生物、医药、食品、工业等领域均有着广泛的利用价值，特别是在生物医药领域。但是目前天然化合物在医药领域的应用还存在一些局限，如水溶性差，生物利用度低等。通过对天然化合物进行结构修饰可以显著改善其水溶差的问题，增加其生物利用度。

糖苷酶由于有转糖基活性，所以其最重要的用途就是糖基化的修饰与合成，由于天然产物结构上的缺陷导致应用性质上的局限，例如水溶性差；另外，天然产物一般来源于植物，这些植物一般较为稀少，且植物本身含量低，故天然产物产量更为低下，所以利用葡萄糖苷酶对天然化合物进行糖基化修饰为解决其应用局限提供了一种可行的方法。

目前对天然化合物进行结构修饰的主要手段有化学法和生物转化法。化学法通过对先导化合物中活泼反应位点的修饰得到一系列的衍生化合物, 经过活性测试及构效关系研究,确定结构中的药效团,然后对药效团以外的部位进行优化使活性和生物利用度提高^[1]。但是化学法合成存在一定缺陷，如反应时需要保护和去保护参加反应的羟基，且反应条件苛刻，步骤繁杂，副产物多，给选择合适试剂带来困难，同时也不利于反应的分离和纯化。生物法是利用生物体系或其产生的酶制剂对外源性化合物进行结构修饰的生物化学过程^[11]。生物转化法较化学法显现出较大的优势,其中酶法合成较生物法和化学法更是具有无可比拟的优点。如反应步骤简单，条件比较温和；无需保护和脱保护； 区域选择性和立体选择性高；产率高，副产物少； 能够进行一些化学方法难以进行的反应；不污染环境等。目前生物转化修饰结构已涉及羟基化、环氧化、糖基化、异构化、酯化、水解、重排、醇和酮之间的氧 化还原、脱氢反应等多种反应类型,其中对天然化合物进行糖基化修饰一直是进来的研究热点^[16]。

1.1糖基化方法

1.化学合成

通常的糖苷化反应都是在糖给体的异头位放上离去基团, 在特定促进剂的活化作用下, 与受体醇羟基发生取代反应形成糖苷键^[2]。常见的糖苷给体有溴苷、氟苷、硫苷、羧酸酯苷、磷酸酯苷等。但是, 由于糖多羟基的结构, 取代反应位置的选择在合成中尤为重要, 一般可通过适当的方法将特定位置的羟基保护, 使之保留生物学活性, 发挥药效。

2.酶促合成法

酶促合成法是利用糖基转移酶作为催化剂合成糖苷化合物的方法, 该方法具有快速、高效、立体专一性和反应条件温和的特点^[3]。糖苷酶以供糖基物质和亲核物质 ( 糖、醇) 为底物，酶催化糖基转移反应，大多数糖苷酶都催化糖基供体上的糖基转移到受体亲核物质上^[14]。糖苷酶来源广泛，比较稳定，能接受不同结构的底物，可直接以非保护或非活化的寡糖为糖基供体,通过逆水解反应实现糖苷合成，被广泛应用于黄酮类化合物糖苷合成中。但是也存在一个缺陷#8212;#8212;转化率较低。一般通过降低转化体系中的水活度以抑制糖苷酶的水解反应使反应向糖苷合成方向进行，加入有机溶剂来增加底物浓度等来提高转化率^[13]。

糖苷水解酶有两种作用机制, 糖苷转化型和糖苷保留型。糖苷转化型水解酶上的活 性中心有两个羧基, 分别充当广义酸和广义碱，在催化机制 中起着重要作用。通过双置换机制保持构型不变来催化反应，反应第一步是酶的糖基化(glycosylation)，亲核体羧基直接作用于底物，形成共价键糖基-酶中间物 (glycosyl-enzyme intermediate)，酸碱羧基先进行酸催化，提供质子，促使底物离去基团 (leaving group)的离去，反应第二步是酶的去糖基化(deglycosylation)，酸碱羧基再 进行碱催化，激活受体分子，发生以水为受体的水解反应和以糖为受体的糖苷键合成反应，后者提供了一条利用糖苷酶合成寡糖的简便途径。此时酶催化反应的可逆性导致的寡糖合成效率较低也可用上述方法改善。糖苷酶不仅可以催化形成寡糖, 也可以将直链或芳香的醇糖基化, 还可以催化多肽、萜 类、酚类、生物碱以及抗生素等物质的糖基化^[12]。

β-葡萄糖苷酶（β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21），又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶（cellobiase，CB或β-G）和苦杏仁苷酶^[4]。1837年，Liebig 和 Wohler 首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶^[5]。研究发现, β-葡萄糖苷酶在纤维素的酶法水 解过程中起着关键作用。Pranita Roy 等将Pichia etchellsii 的β-葡萄糖苷酶的基因进行克隆、测序并将其在大肠杆菌中表达，分析得到开放阅读框1515 bp，预测编码蛋白质量54 kDa，将表达后的酶液进行SDS-PAGE，结果证明蛋白质量为52.1 kDa^[6]。李远华等将与萜烯类香气前体及与抗病虫害有密切关系的茶树β-葡萄糖苷酶cDNA通过pET-32a表达载体构建的重组质粒，转化到Escherichia coli BL21 (DE3) 中表达，诱导产生了63kD的融合蛋白，并主要在细胞质中以可溶性蛋白形式存在^[7]。

β-葡萄糖苷酶作为木质纤维素降解酶系的重要组分,对于其它酶组分的合成有一定的调控作用^[18]。 目前,对斜卧青霉基因组的测序工作已经完成,对其纤维素酶合成调控的研究也已取得一定的进展。但是由于其纤维素酶酶系复杂,涉及的调控层次和调控途径众多,传统的针对单基因的研究方法很难揭示木质纤维素酶合成调控的整体网络因而产量很低，不利于工业应用和纯化因而需要将其克隆并实现其在工程宿主菌株（大肠杆菌）内的异源表达，为纯化和工业化应用打下基础^[17]。完善对合成调控网络的认识,找到工程改造的新靶点。

全细胞生物催化又称为生物转化（biotransformation），其本质是利用微生物细胞内的酶进行催化^[9]，酶催化具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。更加适用于现代化生产^[10]。也是糖基化修饰的一种选择方法。

在现实工业生产中，以纤维素为原料生产燃料乙醇成为许多国家重点发展代替化石能源的一种生物能源产品，而β-葡萄糖苷酶则在纤维素的酶法水解过程中起关键作用；在食品工业中，以葡萄糖为原料，在β-葡萄糖苷酶作用下合成低聚龙胆糖；在医学方面，由于病毒糖蛋白的合成会依赖葡萄糖苷酶的活性，一些科研工作者通过研究葡萄糖苷酶的抑制剂来找到抑制HV的方法；在农业方面，植物β-葡萄糖苷酶能水解野黑樱苷，释放氢氰酸，在植物体病虫防御中起很好的作用^[8]。

本研究以-葡萄糖苷酶产生菌为对象，利用糖基转移酶作为催化剂合成糖苷化合物为天然化合物的糖基化修饰提供新的方法。本研究的开展对于扩大天然化合物在医药领域的应用有着重要的借鉴意义。

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