1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文献综述

脂肪酶

1.1 脂肪酶的简介

脂肪酶的全称为三脂酰甘油酰基水解酶，国际酶学委员会的编号为EC3.1.1.3^[1]。脂肪酶是一类重要的催化酯水解及合成的酶，是一种有高度专一性、催化效率较高专的生物催化剂。

1.2 脂肪酶的结构及催化机理

目前，已经大约有2000种脂肪酶被分离纯化出来，并且人们通过现代科技确定了脂肪酶的结构^[1]。脂肪酶的催化活性三元组大多数情况下是由一个丝氨酸、一个天冬氨酸和一个组氨酸组成，不同类型的脂肪酶分子具有较为相似的立体结构，但是氨基酸序列差别比较大，多样性比较高，但它们的分子结构有两个相同的特征：第一它们的活性中心为丝氨酸残基；第二它们含有同源区段：His-X-Y-Gly-Z，Ser-W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly（其中X、Y、W、Z代表可变的氨基酸残基）^[2]。同时，脂肪酶的催化活性位点上方一般有一个”盖子”，而正是由于这个”盖子”，所以脂肪酶表现有界面活性^[2]。

1.3 脂肪酶应用的不足

脂肪酶在实际应用中存在一定问题^[3-5]，主要有以下四个方面：

（1）游离脂肪酶稳定性较差，在反应中容易受pH、温度等外界环境因素的影响，导致脂肪酶活性降低；

（2）游离脂肪酶在反应中溶于反应体系过程后，故反应结束后难以回收利用；

（3）反应若在非水的溶剂体系中进行，则游离脂肪酶不易溶解而易发生聚集现象，导致酶的利用率较低；

（4）在某些催化反应，其反应底物不溶于水，为解决这个问题，需要加入合适的溶剂或乳化剂来溶解底物，而这种操作不利于酶的回收利用，且降低产率。

酶的固定化方法

研究者们一直致力于酶固定化技术的研究，虽然具体的固定化方法达百种以上，但迄今为止，几乎没有一种固定化技术能普遍适用于每一种酶，所以要根据酶的应用目的和特性，来选择其固定化方法。目前已建立的各种各样的固定化方法，一般可以分为吸附法、包埋法、交联法和共价偶联法四种^[6,7]。

吸附法是利用物理吸附、离子键、生物特异性等方法，将酶固定于琼脂糖、纤维素等多糖类或多孔玻璃、多孔树脂等载体上的固定方式。工艺简便及条件温和是其显著特点，其载体选择范围很大，涉及天然或合成的无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化，酶失活后可重新活化，载体可以再生^[8]。

包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微囊结构中。这样可以防止酶蛋白释放，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。此法较为简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。

交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，是酶分子和多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内交联。根据使用条件和添加材料的不同，可产生不同物理性质的固定化酶。共价法是指酶蛋白分子上功能基和载体上的反应基团之间形成化学共价键连接，结合力牢固，使用过程中不易发生酶的脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂，反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。

表1比较了各种固定化方法对所制得的固定化酶的影响，在制备固定化酶时应结合固定化载体的选择、固定化过程中的物理化学反应以及操作成本等因素综合考虑以确定最佳的固定化方法。

表1 不同固定化方法比较

Tab.1The comparison of various immobilized method

大孔树脂固定化脂肪酶

国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）规定，孔径小于2.0 nm的为微孔，孔径介于2.0-50 nm之间的为介孔，大于50 nm的为大孔^[9]。大孔树脂是一类不含离子交换基团，具有大孔结构的高分子吸附剂。理化性质稳定，一般不溶于酸碱及有机溶剂中。对有机物有浓缩、分离的作用，且不受无机盐类及强离子、低分子化合物的干扰。大孔树脂的吸附性能与范德华力或者氢键有关，这点性质类似于活性炭。同时，由于大孔吸附树脂具有网状结构和高比表面积，使其具有筛选性能^[10]。

大孔树脂随制备条件及原料性质的不同, 性能差异很大。根据树脂的表面性质，大孔树脂可分为非极性、中极性以及极性三类^[11]。非极性树脂是由偶极距很小的单体聚合而得，不含任何功能基团，孔表的疏水性较强，可通过与小分子内的疏水部分的作用吸附溶液中的有机物，最适用于从极性溶剂中吸附非极性物质。中极性吸附树脂含有酯基,其表面兼有疏水和亲水部分，既可由极性溶剂中吸附非极性物质,也可以从非极性溶剂中吸附极性物质^[12]。极性树脂含有酰胺基、氰基、酚羟基等含N、O、S极性功能基,它们通过静电相互作用吸附极性物质。

大孔树脂分离技术是20世纪60年代末发展起来的继离子交换树脂后的分离新技术之一 。何炳林^[13]以”吸附与吸附树脂”为题，就国内外关于大孔吸附树脂的吸附作用、影响因素的研究，以及在环保、医药、轻纺等方面的应用和实验室工作作了较为系统的介绍。随着对大孔吸附树脂研究的进一步加深，它的应用也越来越广泛，对于它的分离机理研究方面也逐步深入。目前，大孔树脂主要应用于环保、医药工业、化学工业、分析化学、临床鉴定等多个领域。

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

1.研究的问题

1.脂肪酶的吸附固定化方法

2.酶蛋白装载量及吸附率的测定方法