文 献 综 述

白藜芦醇是3,4',5-三羟基芪，又称虎杖甙元、茋三酚、芪三酚等。其分子式为C₁₄H₁₂O₃ , 相对分子量为228.25， 具有顺、反2种结构，反式结构更为稳定。主要存在于葡萄（红葡萄酒）、虎杖、桑葚、花生等植物中。白藜芦醇最初于1940年被Takaoka从植物毛叶藜芦的根部提取出来^[1]，被认为是一种植物抗毒素^[2]。经过多年体内体外研究表明白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类化合物,具有多种生物学作用，包括抗氧化^[3]、抗自由基、抗炎^[4]、抗癌^[5]、抗衰老^[6]，抗糖尿病^[7]、保护心血管^[8]等。

对造成动脉粥样硬化和血栓形成的各种氧化反应起抑制作用^[9]10]。正因如此，白藜芦醇通常作为肿瘤的化学预防剂，也作为对降低血小板聚集，预防和治疗心脑血管疾病的化学预防剂。

尽管白藜芦醇有诸多功能，但是它的水溶性较低，进入人体后生物利用度也不理想,这就极大地限制了白藜芦醇作为有潜力的药物进行临床开发应用。针对此状况，科学家们设计了多种方法来解决此问题，例如脂质体包埋制剂工艺以及环糊精工艺开发出的复合物等可以有效提高白藜芦醇的水溶性。

虎杖苷是白藜芦醇3-O-β-葡萄糖苷，其4#8217;-OH并未被修饰，而游离的4#8217;-OH羟基在多种生理活性中起重要作用。水中溶解度是白藜芦醇的31.5倍，同时抗氧化活性相当，因而饱和水溶液的抗氧化活性显著提升。虎杖苷也具有多种生物活性，如降血脂及抗脂质过氧化作用、抗血小板聚集和改善微循环、抗衰老、抑制癌细胞增殖等。因其具有重要的生物活性和治疗潜力，虎杖苷的合成日益受到关注。以白藜芦醇为糖苷配体合成虎杖苷，糖基化的立体选择性和区域选择性是需要解决的问题。其中，生物催化糖基化由于其良好的选择性以及避免化学合成中的保护/解保护操作的特点，成为合成虎杖苷的一条较理想的途径^[11]。

糖基转移酶（Glycosyltransferases，GT，EC 2.4.x.y）是一类催化糖基转移的酶，通过产生糖苷键将供体糖分子或相关基团转移至特异分子上。所有机体中几乎都有糖基转移酶的存在，参与催化重要的生物转化反应---糖基化反应。直接参与二糖、单糖苷、聚糖苷等的生物合成。糖基供体分子包括双糖、多糖、1-磷酸糖、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸^[12]，植物中最常见的供体为UDP-葡萄糖^[13]。受体可以是糖类、脂类、蛋白质、抗生素和核酸。糖基化可以改善或改变受体分子的亲水性、亲油性、稳定性、生物活性等。

综上所述，白藜芦醇的糖基化就能通过糖基转移酶来进行。糖基转移酶UGT_BL1能够将活化糖UDP-葡萄糖的糖基接连到白藜芦醇分子的羟基上，且发生异头碳翻转而形成β构型糖苷（如图1所示）。可是UGT_BL1主要在白藜芦醇的4#8217;-OH进行糖基化从而生成4#8217;-O-β-葡萄糖苷，而3-OH被糖基化而形成的3-O-β-葡萄糖苷才是我们所需要的产物，即虎杖苷。

UGT_BL1野生型对4#8217;-OH相对于3-OH亲和性高。为了更有效地获得虎杖苷，我们需要对糖基转移酶UGT_BL1进行蛋白质工程改造。

目前，糖基转移酶UGT_BL1的晶体结构还不清楚，导致UGT_BL1对白藜芦醇4#8217;-OH和3-OH 区域选择性差异的缘由也尚未明晰。这给糖基转移酶UGT_BL1蛋白质工程改造造成了一定的阻碍。纵使有相应的蛋白质结构和生物化学信息作为参考，可是通过理性设计的方式成功对天然产物区域进行选择性改造的案例寥寥无几^[14]。定向进化是一种无需知道蛋白质晶体结构信息但也能使蛋白质工程进行成功的方案。然而又缺乏适用的无特异性的糖基转移酶检测方法，从而加大了工作量，限制了此方案的应用，况且从大量的突变体中筛选出性能提升的突变体是相当耗费人力物力。最后，我们选择采用基于UGT_BL1的同源模型指导的办理性设计，通过较少的实验量，实现UGT_BL1对白藜芦醇区域选择性的改造。

丙氨酸扫描技术是在目标蛋白质的特定区域的带电氨基酸残基上引入一个或几个丙氨酸,观察这些改变对蛋白功能的影响。丙氨酸侧链体积小，不含其它活性官能团。而甘氨酸则由于α碳没有手性，可能严重影响蛋白质功能结构，所以采用对蛋白质结构影响较小的丙氨酸，可以获得较规整的突变体库，避免了大量随机突变体的构建^[15]。