1.1 荧光素酶的简介

荧光素酶（Luciferase）是存在于生物体内能够催化荧光素或者脂肪醛氧化使生物产生荧光的酶的统称。常见的产生荧光的生物有很多，像发光鱼，发光蘑菇，萤火虫，发光细菌等。其中萤火虫体内的萤光素酶（Photinus pyral）最具有代表性。在其化学反应中，萤火虫萤光的产生是源于荧光素酶催化下的萤光素的氧化。 荧光素酶的种类有很多，如：细菌荧光素酶（Bacterial Luciferase，简称BL）、萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）以及其他荧光素酶。荧光素酶的种类繁多，其中以细菌荧光素酶和萤火虫荧光素酶的研究最为详细。目前自然界中常见的可以产生萤火虫荧光素酶的生物有：北美萤火虫（Photinus pyralis）、日本萤火虫（Luciola cruciata）、欧洲萤火虫（L.mingrelica）、中华黄萤（L.Chinesis L）等；其中北美萤火虫是目前萤火虫荧光素酶发光体系中研究和应用最多的。可以提取细菌荧光素酶的生物主要有：埃希氏菌(Escherichia coli)、明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum )、羽田希瓦氏菌（Alteromonas hanedai）、费氏弧菌(Vibrio fischeri)等多种发光菌中提取出细菌荧光素酶；

1.2 荧光素酶的结构

1.2.1 萤火虫荧光素酶

萤火虫荧光素酶是由单一的多肽链组成的蛋白质和脂类复合物，相对分子质量约为60-64 kD。来源于不同种类萤火虫的荧光素酶的分子量和结构也有所不同，其中报道最多的是来源于北美萤火虫的荧光素酶，分子量约为62 kD，由550个氨基酸残基构成^[1]；而来源于日本萤火虫和东欧萤火虫的萤光素酶相似，分子量约为61 kD，由548个氨基酸残基构成^[2]。

1.2.2 细菌荧光素酶

能够产生细菌荧光素酶的发光细菌种类很多，但是绝大部分都是发光杆菌属，弧菌属，和异短杆菌属。与萤火虫荧光素酶不同的是细菌荧光素酶是一种异源二聚体，它是由α、β两个多肽亚基组成的相对分子质量约为77 kD的加单氧酶。基因luxA和luxB分别编码α, β两个多肽亚基，其中α-亚基分子量约为40 kD，β-亚基分子质量约为37 kD。只有当α、β亚基共同存在时细菌荧光素酶才有活性，单独的α、β亚基均没有发光活性。此外，有研究表明，细菌荧光素酶的催化能力和结构特点是由α-亚基控制的，酶与底物的结合点在α-亚基上，β-亚基是活性结合所必需的，但目前关于β-亚基的具体作用尚未有报道^[3,4]。

1.3 荧光素酶的应用

1.3.1 在微生物检测中的应用

由于荧光素酶具有特异性好、灵敏性高它的灵敏度比CAT至少高100倍、反应迅速、操作简便、对生物体无毒害作用等诸多优点，此外萤火虫荧光素酶另一大优点就在于它不损害检测对象，便于从整体水平或从离体器官测定基因产物是否表达[5, 6]。荧光素酶越来越多的被应用于微生物探针、分子生物学、食品卫生检测、环境监测、药物筛选等相关领域^[5-7]。

ATP广泛存在于所有活的生物体中，含量稳定，是生命活动能量的直接来源。20世纪80年代，Moyer等和Grouml;nroos等分别提出和证实细胞内ATP的含量可以准确、灵敏的反映活细胞的数量^[8,9]。而荧光素酶在Mg2 ，ATP和O2存在的条件下，可以催化D-荧光素（D-Luciferin）氧化脱羧将化学能转变成光能，发出黄绿色荧光。当荧光素和其他成分过量时，发光强度与ATP的浓度成正比，可由此制作ATP浓度-发光强度的标准曲线。每个细胞体内的ATP含量大致是一定的，如：大肠杆菌的ATP含量为1.4 #215; 10-18 mol/细胞，将细胞破碎释放ATP并检测其发光强度，根据预先测定的ATP标准曲线，可测得细菌总数。

近年来，我国食品安全问题层出不穷，快速、准确的检测食品从生产、加工到销售各个环节是否卫生对我们每一个人至关重要。基于荧光素酶的ATP检测法可以在1分钟内检测出食品、药品以及生活环境等中的细菌总数，相比传统的平板计数法，利用荧光素酶发光法更加简便、快捷。因此，荧光素酶被广泛应用于医疗环境、器械表面新生儿监护病房、血液及烧伤病房等地洁净度的检测、评估水样或废液样的化学及生物污染的检测等。

1.3.2 在生命科学研究中的应用

因为ATP是荧光素酶发光反应体系中的必须底物，而ATP又是所有生命活动的能量来源，因此可以通过检测发光值来探索生命活动，这为荧光素酶开拓了更为广泛的市场应用。在探索宇宙的生物学研究中，美国太空总署曾利用荧光素酶的发光反应原理检测月球样品中是否含有痕迹量ATP，并以此作为月球是否存在或曾有过生命活动的证据^[10]。

1.4 提高蛋白质稳定性的方法

目前，有多重技术可以提高蛋白质的热稳定性，主要有以下几种：化学修饰、添加稳定剂、蛋白质工程、蛋白环化和翻译后修饰等。