摘 要

木犀草素作为一种天然的黄酮类化合物对睾丸组织具有较好的保护能力，但其中的作用机制仍不明确。建立雷公藤甲素诱发小鼠支持细胞损伤细胞模型，通过采用木犀草素(2.5、5和10μmol/L)预处理治疗，检测细胞存活率、细胞凋亡率、线粒体膜电位和细胞内总ROS含量，研究木犀草素对雷公藤甲素诱发睾丸支持细胞损伤的保护作用；体外血睾屏障通透性实验研究木犀草素对雷公藤甲素诱发的血睾屏障损伤的修复作用；进一步采用RT-PCR和Western blot法检测血睾屏障相关连接蛋白基因和蛋白的表达情况。同时通过建立雷公藤甲素诱发的小鼠睾丸组织损伤模型并给予木犀草素组（20mg/kg）治疗保护14天，观察睾丸组织形态及血睾屏障显微结构。结果表明：木犀草素对雷公藤甲素诱发睾丸支持细胞直接损伤具有一定的保护作用、可以有效的逆转雷公藤甲素所致的血睾屏障通透性下降，恢复连接蛋白的表达。体内结果进一步显示木犀草素可以有效的保护雷公藤甲素所导致的睾丸组织形态和血睾屏障显微结构的破坏。

关键词：木犀草素；雷公藤甲素；睾丸支持细胞；氧化应激；血睾屏障

Abstract

Luteolin, a natural flavonoid, displays potent protective activities to testicular tissue. However, the cellular and molecular mechanisms are still unclear. In this study, we aimed to demonstrate the protective effect and mechanisms of Luteolin in triptolide (TP)-induced Sertoli cells (SCs) and testicular damage models. Pre-incubation of SCs with Luteolin resulted in a significant increase in cell viability and reduction in the numbers of TP-induced mitochondrial mediated apoptotic cells, which occurred concomitantly with the effective inhibition of ROS accumulation and suppression of apoptosis. Treatment with Luteolin leads to a significant reduction in testicular damage and spermatogenic dysfunction in mouse model.Meanwhile, Connexin43 (Cx43), a gap junction protein that transduces mechanical signals, is an important determinant of maintaining the blood-testes barrier (BTB) integrity and spermatogenesis. Besides inhibiting apoptosis, Luteolin exhibited enhanced gap junction intercellular communication (GJIC), and elevated Transepithelial electrical resistance (TER) values of Sertoli cells further to recovered BTB integrity by up-regulation of Cx43 expression. And specifically blocks Cx43 activity further exacerbated TP-induced blood–brain barrier disruption and completely blocked repairmen of TER values by Luteolin. In coincided with in vitro results, Luteolin significantly suppressed testicular injury and spermatogenesis dysfunction via Cx43 in the TP-induced testicular injury model of mice. Our study has identified Luteolin as a novel active in gradient that contributes to the protective activity in testicular damage

Keywords Luteolin; Triptolide; Sertoli cell; ROS; The blood-testes barrier (BTB)

目录

摘要 I

Abstract III

第一章 文献综述 1

第二章 实验材料与方法 4

2.1 实验材料 4

2.2 实验方法 4

2.2.1 细胞的保存与培养、 4

2.2.2 细胞存活率实验 4

2.2.3细胞凋亡率的检测 5

2.2.4细胞内总ROS的检测 5

2.2.5细胞线粒体膜电位的检测 5

2.2.6体外血睾屏障通透性实验 6

2.2.7 荧光示踪法测定细胞间连接通讯（GJIC） 6

2.2.8 免疫印迹实验 6

2.2.9 RT-PCR实验 7

2.2.10睾丸组织形态学观察 8

2.3 统计学方法 9

第三章 结果 10

3.1木犀草素对雷公藤甲素诱发的睾丸支持细胞损伤的保护作用 10

3.2木犀草素对雷公藤甲素损伤睾丸支持细胞凋亡率的影响 10

3.3木犀草素的保护作用对雷公藤甲素毒性导致的睾丸支持细胞内总ROS的影响 11

3.4 木犀草素的保护作用对雷公藤甲素毒性引起的睾丸支持细胞线粒体膜电位降低的影响 12

3.5木犀草素的保护作用对雷公藤甲素引起的支持细胞血睾屏障功能损伤的影响 13

3.6.木犀草素可以改善细胞间连接通讯功能 14

3.7木犀草素对支持细胞血睾屏障功能相关蛋白功能的影响 15

3.8木犀草素诱导睾丸支持细胞Cx43等连接蛋白基因的表达 16

3.9 木犀草素对雷公藤甲素诱发的小鼠睾丸组织损伤的保护作用 17

讨论 20

参考文献 23

致谢 26

第一章 文献综述

当今社会，男科病中多发病之一即为男性不育症，男性不育症十分常见，据WHO调查，在育龄夫妻中存在不育问题的接近15%。流行病调查结果显示：近50年以来，男性的精子密度降低近乎了1倍，美国男性的精子数量也几乎每年下降1.5%。可以看出睾丸的生精功能障碍是导致男性不育的重要原因之一。精子的产生是个非常复杂的生理过程，在这个过程中有多个系统参与调控，如内分泌、免疫等而在这过程中无论哪里出现了问题，最终都会影响机体产生精子。此外，机体中还有一个结构与精子的生成密切相关，此结构即为睾丸血睾屏障( blood-testis barrier, BTB)，因此在机体生精功能病理研究中，睾丸支持细胞( Sertoli cells，SCs)越来越受关注。睾丸损伤是使精子数量和质量下降并直接致男性不育的最重要因素之一。 已有的研究表明显示氧化应激在睾丸的损伤中起到主要作用。由疾病（例如糖尿病，肥胖症和高脂血症）、空气中的污染物或具有生殖毒性的药物引起的活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累与机体抗氧化能力之间平衡的破坏^[1]，将导致睾丸组织的功能和结构损伤。当外源性具有生殖毒性的药物进入机体后一般需要先跨过睾丸血睾屏障或者直接将其结构破坏，进而才能作用于各个生精功能相关的靶点，在这个过程中睾丸血睾屏障显得尤为重要。睾丸血睾屏障主要由四大部分组成，分别是血管内皮细胞、支持细胞、生殖细胞和基质膜，在这四大组成部分中，支持细胞的作用尤为重要。

构成睾丸骨架的睾丸支持细胞不仅能够为生精细胞的分化和生长提供支架、营养物质和能量以及多种生长因子^[2]，而且它所组成的血睾屏障不仅可以限制细胞外小生物分子（比如离子、糖类水）于基底和顶端隔室之间，又可以将某些生物大分子物质屏蔽在血管和淋巴内从而阻止它进入们生精上皮，而且可以为生精细胞的发育提供稳定的微环境，还可防止精子逸出而发生自身免疫反应。对生精细胞和精子发育成熟至关重要。除了机体的直接损伤（睾丸支持细胞的凋亡）和睾丸的功能性损伤，血睾屏障的异常也是造成生精功能紊乱的主要原因之一。当睾丸血睾屏障开放后，外源性化学毒物极容易进入生精上皮，继而引起直接的生殖毒效应。

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