文献综述

一种检测β-半乳糖苷酶的喹唑啉酮类荧光探针的合成及其生物成像

一、研究背景

1.1β-半乳糖苷酶简介

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase),全名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactosidegalcag- alcato-hydrolase,EC3.1.23)常简称为乳糖酶（结构如图1所示）,广泛存在于各种动物、植物及微生物中,是一种能够从神经节苷脂,糖蛋白,鞘脂和硫酸角蛋白中去除半乳糖残基的酶^[1]。而且,β-半乳糖苷酶是一种常用的检测转录和转染效率的报道基因,它同样是监测细胞衰老的一个非常重要的生物标记物,在维持正常的生命活动中具有举足轻重的作用。

图1 β-半乳糖苷酶结构式

1.2来源

β- 半乳糖苷酶来源主要有: ① 植物, 尤其是杏、桃和苹果; ② 细菌, 大肠杆菌和乳酸菌; ③ 真菌, 米曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、热带假丝酵母和放线菌; ④ 哺乳动物, 特别是在婴儿的肠道中^[2]。目前,来源于微生物中的β-半乳糖苷酶具有重要工业应用价值^[3]。

1.3作用

β-半乳糖苷酶能够催化β-半乳糖苷化合物中的β-半乳糖苷键发生水解,还具有转半乳糖基的作用。早期的研究表明,β-半乳糖苷酶上的活性位点有两个功能团：Cys的巯基和His的咪唑基,它们对β-半乳糖苷酶水解乳糖起重要作用^[4]。据推测,硫基可作为广义酸使半乳糖苷的氧原子质子化,而咪唑基中的氮原子为富电子基团,可作为亲核试剂进攻半乳糖分子中的碳正离子,形成一个含碳氢键的共价中间物。在被切割下咪唑基之后,巯基阴离子从水分子中抽取一个质子,水分子形成OH^-进攻C^[5]。有研究认为乳糖酶的催化机制与溶菌酶类似^[6],当半乳糖苷的受体是水时,发生的是水解;当受体是另外的糖或醇,则发生转半乳糖苷作用;如受体是乳糖,则可以生成三糖型低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶普遍存在于各种植物中,了解它在果蔬中各个生长时期的含量对于果蔬的成熟、风味、颜色及采收后加工都有重要意义。一般在植物成熟期β-半乳糖苷酶含量增加,它降解含半乳糖苷的胞壁多糖,释放游离的半乳糖,可溶性的半乳糖能促进胡椒成熟,对番茄能促发乙烯加快成熟。β-半乳糖苷酶已用于梨、苹果、土豆和中国水粟的软化和番茄、胡椒、甜瓜、樱桃、核果和牛油果的成熟^[7]。生物技术的发展使生产的β-半乳糖苷酶纯度更高、活性更强、更利于生产上实际操作。对其反应机制,动力学行为的深层研究,使此酶的应用不再仅仅限于乳糖水解,广泛应用在食品、医药、免疫、环境检测等各个领域。也由于近20年来基因工程、酶工程、蛋白工程的迅猛发展,对编码该酶的基因及其表达调控在分子水平上做了大量深入研究,如重组基因、融合蛋白等,反过来也促进了生物技术诸多领域的发展。此外,在原发性卵巢癌中β-半乳糖苷酶会过度表达,因此可作为卵巢癌可视化检测的分子靶点^[8]。相反,β-半乳糖苷酶在体内表达不足也会导致Morquio B(莫尔基奥乙综合征综合症)或Galactosialidosis(为一种溶酶体储积病) 。因此,在遗传学领域中对人类β-半乳糖苷酶缺陷病的诊断和基础研究也具有重要意义。此外,β-半乳糖苷酶能够水解乳糖,制备低含量,甚至零含量的乳制品,解除乳糖不耐症人群由于食用乳制品所引起的不良反应,促进乳制品行业的发展。

1.4、β-半乳糖苷酶的应用

4.1降解乳糖和生成低聚半乳糖

4.2合成或修饰其它碳水化合物以及促进果蔬软化和成熟

4.3利用β-半乳糖苷酶筛选好的基因表达系统^[6]

4.4在免疫、检测及疾病诊断方面的应用^[7]

1.5常用的检测方法

5.1比色法

5.2化学法

5.3光谱法

5.5细胞化学染色法

5.5表面等离子共振光谱法

5.6荧光探针法

二、荧光探针

2.1简介

荧光探针^[9]是指荧光性质(如荧光强度、荧光寿命、激发和发射波长)受到周围环境影响、特定刺激、结合被分析物而发生特异性改变(紫外吸收光谱、荧光探针颜色、荧光强度等变化)的一类荧光物质。荧光探针包括有机染料、发光纳米颗粒、荧光蛋白等,已经被广泛研究并被应用于环境检测、有毒有害物质分析检测、生物化学检测、肿瘤成像与细胞成像等领域^[10]。

荧光分子探针作为传感器具有灵敏度高、操作简单、高的时间和空间分辨率等优点。作为一种选择性好、灵敏度高、检出限低的微量分析技术,荧光分子探针可以对分析对象进行实时,在线检测。荧光分子探针通常由三个部分组成^[11] (如图2)

图2荧光分子探针的结构示意图

（1）识别目标检测物的受体部分(receptor),即识别基团或键合基团,它的功能主要是结合客体并将结合的信息传递给荧光团,使荧光团所处的化学环境(或本身的性质)发生改变。

(2)荧光团(fluorophore),即信号基团,它的主要功能是吸收光能,发出荧光信号且它的荧光强度或波长的改变与识别基团的结合状态有直接关系。

(3)连接部分也称间隔基团(spacer),它的功能是连接荧光团和受体,使识别信息有效地转化为荧光信息的变化,实现对待测物的定性和定量检测。

2.2荧光探针的种类

①双光子荧光探针：基态荧光分子或者原子同时吸收两个光子激发至激发态,通过池浴过程,辐射出频率略小于两倍入射频率的荧光光子^[12]。

②聚集诱导型荧光探针：聚集诱导发光现象是由我国科学院士唐本忠发现,在2000年Tang研究组发现1-甲基-1,2,3,4,5-五苯基硅杂环戊二烯溶解在乙醇中时几乎没有荧光;但将1-甲基-1,2,3,4,5-五苯基硅杂环戊二烯的乙醇溶液滴在薄层色谱板上,乙醇挥发后这种物质的聚集体会表现出明显的荧光,他们将1-甲基-1,2,3,4,5-五苯基硅杂环戊二烯的这种反常规的荧光现象定义为聚集诱导荧光^[13]。除1一甲基一1,2,3,4,5一五苯基硅杂环戊二烯具有聚集诱导荧光性质外,Tang研究组还发现和1一甲基一1,2,3,4,5一五苯基硅杂环戊二烯具有类似结构的硅杂环戊二烯衍生物都有聚集诱导荧光性质。在充分的实验证据的基础上,Tang研究组提出硅杂环戊二烯衍生物的聚集诱导荧光机理是:在良溶剂中,分散的单个硅杂环戊二烯衍生物分子中的苯环取代基绕C-C单键的自由旋转消耗了分子激发态能量,分子激发态能量的非辐射衰减使得分子荧光微弱;而在分子聚集时,分子间的相互作用使得分子中的苯环取代基绕C-C单键的自由旋转受阻,分子激发态能量的非辐射衰减受到抑制,激发态分子便以辐射衰减的方式回到基态,产生强荧光^[14]。2001年,Tang研究组发现硅杂环戊二烯衍生物在溶液中几乎不发光,而在形成固体后发光大大增强,他们将此现象定义为”聚集诱导发光(Aggregation-induced-luminescence,AIE)”现象。传统荧光生色团多为具有大二共扼体系的刚性平而分子,在稀溶液中有很高的荧光量子产率,但在聚集状态下荧光减弱甚至不发光,即聚集导致了荧光淬灭(Aggregation-caused-quenching,ACQ),然而聚集诱导荧光是一种反常规的发光现象,它在分散态时表现为弱荧光,而在聚集态时产生聚集诱导荧光(Aggregation-induced-emission,AIE）,这有效的克服了传统的荧光染料在聚集时荧光淬灭的缺点。

2.3荧光探针法优势

传统的β-半乳糖苷酶检测技术如比色法、电化学法、表面等离子共振光谱法等,大多存在检测限高、特异性差、损害性强等局限性,无法实现在细胞水平对β-半乳糖苷酶含量进行实时原位无损的检测^[15]。荧光探针法具有灵敏度高、选择性高、操作简捷,并且可以提供无损耗的时空分布信息等优势。高灵敏度的荧光检测技术可以实现生物体内低含量的物种的检测,而通过合理优化修饰后的荧光探针可以对单一物种特异性地响应并且排除其他因素的干扰,同时相比较其他检测方法所需的复杂的过程,它的操作方便快捷,最重要的是它可以在不损伤生物样品的前提下提供被分析物种在不同时间和空间分布上的信息,这对研究重要生物物种的生理功能具有非常重要价值。因此,荧光探针法广泛应用于环境监测、食品分析、医学诊断、过程控制等许多领域^[16],也成为了目前检测和探明生命体系中各个重要物种的非常重要并且行之有效的方法。

参考文献

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