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摘 要

人参历来是补药的代名词，其中含有的稀有人参皂苷极具药用价值。对人体诸如心血管系统、肝脏和肾脏等器官和系统都具有特定的药理效用，应用广，需求大，由于稀有人参皂苷天然含量极低，且不易分离提取或提纯条件苛刻，难以大量获得。化学合成需要多步的保护或脱保护步骤，立体选择性和区域选择性导致合成效率较低，反应条件也相对苛刻。本研究利用生物酶合成法合成人参皂苷，通过对微生物来源的糖基转移酶UGT_BL1进行结构分析，了解该酶的活性位点和与底物的结合位点，由分子对接、定点突变等手段挖掘并改造活性位点的关键氨基酸，提高糖基转移酶UGT_BL1催化原人参三醇的糖基化反应和糖基化过程中的区域选择性，从而实现稀有人参皂苷Rh1的定向高效合成。

关键词：人参皂苷 糖基转移酶UGT_BL1 定点突变 分子对接

Screening and modification of glycosyltransferase "hot spot" amino acids for catalyzing ginsenoside synthesis

Abstract

Ginseng has always been synonymous with tonic. The rare ginsenoside contained in it is of great medicinal value. It has corresponding pharmacological effects on the human organs and systems such as the Cardiovascular System, liver and kidneys. It has a strong versatility and is in great demand. Due to the extremely low natural content of rare ginsenosides and the difficulty in separation, extraction or purification, so it is difficult to obtain in large quantities. Chemical synthesis lacks an effective glycosidic bond synthesis method. Stereoselectivity and regioselectivity lead to low synthesis efficiency and relatively harsh reaction conditions. This thesis is designed to synthesize ginsenosides by bioenzymatic synthesis. Through structural analysis of microbial-derived glycosyltransferase UGT_BL1, the active site of the enzyme and its binding site to the substrate can be known, and then through molecular docking, site-directed mutation and other means to excavate and modify the key amino acids in the active site, to improve the efficiency of the glycosyltransferase UGTBL1 in catalyzing protopanaxatriol and the regioselectivity in the glycosylation process, thereby achieving the efficient and targeted synthesis of rare ginsenoside Rh1.

Key Words: Ginsenoside；Glycosyltransferase UGT_BL1；Site-directed mutation；Molecular docking

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1概述 1

1.2 人参皂苷的功能 3

1.3 人参皂苷的合成方法 3

1.4 糖基转移酶合成人参皂苷相关研究进展 4

第二章 实验材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.1.1菌株与质粒 5

2.1.2实验试剂 5

2.1.3实验仪器设备 7

2.1.4培养基 8

2.1.5 SDS-PAGE蛋白分析技术相关试剂的制备 8

2.1.6大肠杆菌感受态细胞的制备 9

2.1.7计算平台及相关软件 9

2.2 实验方法 10

2.2.1 糖基转移酶UGT_BL1的制备 10

2.2.2 原人参三醇酶法糖基化的体系构建 10

2.2.3 糖基转移酶UGT_BL1同源建模 10

2.2.4 糖基转移酶UGT_BL1和原人参三醇底物分子对接 11

2.2.5 糖基转移酶UGT_BL1丙氨酸扫描突变 12

第三章 结果与讨论 16

3.1糖基转移酶UGT_BL1催化原人参三醇糖基化 16

3.1.1糖基转移酶UGT_BL1在大肠杆菌中的表达 16

3.1.2糖基转移酶UGT_BL1催化原人参皂苷结果 17

3.2 分子对接结果及突变位点的选择 18

3.3 关键氨基酸位点的突变结果 19

第四章 结论与展望 20

4.1结论 20

4.2展望 20

参考文献 21

致谢 23

第一章 文献综述

1.1概述

人参历来是补药的代名词，更是被誉为“东北三宝”之一。从十九世纪末研究以来，人们就致力于研究人参，且在人参中发现人参皂苷、挥发油^[1]、多糖^[2]，多肽等多种对人类有利物质^[3]。其中，人参皂苷为主要活性物质，应用较广，故几年来，对人参皂苷的性质及结构改造研究受到人们热烈关注。人参皂苷属植物萜类皂苷,糖苷键连接糖和苷元两个基元而成的化合物，是人参对人体产生药理效应的关键活性物质^[4]。人参皂苷制备可以利用原人参二醇 （protopanaxadiol，PPD）和原人参三醇（protopanaxatriol，PPT）作为底物，得到活化供糖体的糖基修饰即可^[5]。而糖基转移酶在迁移糖基过程至关重要。

人参皂苷种类繁多，目前已经分离得到的各种人参皂苷可达150多种^[6]。依据不同，划分则不同。典依苷元划分有原人参二醇类皂苷、原人参三醇类皂苷、齐墩果酸类皂苷和其他类皂苷^{[7, 8]}。二醇类皂苷和三醇类皂苷分别以PPD和PPT为底物（即受糖体），UDPG为供糖体，经酶法转移糖基，从而体外催化合成人参皂苷类化合物。二醇型皂苷包括 Rb1、Rd、Rg3等^[9]；; 三醇型皂苷包括 Re、Rg1、Rh1 等^[10]。

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