论文总字数：22832字

摘 要

脂肪酶（Lipase, EC 3.1.1.3）具有独特的“界面激活”效应，当处于有机溶剂中能够保持较高的活性、高度专一性、立体选择性及区域选择性，被广泛应用在手性化合物等领域。固定化脂肪酶相较于游离酶固定化酶具有可以很容易与底物分离、可重复利用。在脂肪酶固定化过程中载体的构建运用到3D打印技术，其是一种新颖、省时、适用于多种材料的新兴自下而上制造技术，被快速运用到生物领域。本论文研究了不同链接臂结构对固定化脂肪酶的影响以及脂肪酶催化最佳反应温度和pH。

关键词：脂肪酶 固定化 3D打印 聚乳酸

Immobilization of lipase on 3D printing carrier

Abstract

Lipase (EC 3.1.1.3) has a unique "interface activation" effect. When it is in organic solvent, it can maintain high activity, high specificity, stereoselectivity and regioselectivity, so it is widely used in chiral compounds and other fields. Compared with free lipase, immobilized lipase is easy to separate and reuse. In the process of lipase immobilization, the construction of carrier is applied to 3D printing technology, which is a new, time-saving, emerging bottom-up manufacturing technology suitable for a variety of materials, and is rapidly applied to the biological field.In this paper, the effect of different linker structure on immobilized lipase was studied, and the optimal reaction temperature and pH value of immobilized lipase were determined.

Key words: lipase;immobilized ;3D printing ;PLA

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 综述部分 1

1.1 脂肪酶 1

1.1.1简介 1

1.1.2脂肪酶的结构 1

1.2关于脂肪酶的应用 2

1.2 脂肪酶的固定化 6

1.3.3 固定化载体 7

1.4 3D打印技术与高分子聚乳酸材料 8

第二章 脂肪酶 YCJ01的定向固定化 9

2.1前言 9

2.2本次实验所需要的实验材料 9

2.2.1试剂 9

2.2.2仪器 9

2.2.3菌种来源 9

2.2.4培养基 9

2.3实验方法 10

2.3.1脂肪酶YCJ01制备 10

2.3.2 3D载体设计 11

2.3.3聚乳酸载体的表面修饰 12

2.3.4 固定化脂肪酶YCJ01的制备 13

2.3.5 脂肪酶固定化酶学参数计算 14

2.3.6脂肪酶YCJ01固定化工艺参数研究 15

2.4结果与讨论 16

2.4.1载体修饰过程参数优化及结构表征 16

2.4.2关于固定化工艺的简单条件优化 18

2.4.3关于固定化工艺参数研究 19

2.4.4两种状态脂肪酶pH稳定性和最适反应pH研究 21

2.5小结 23

第三章展望 24

致谢 29

附录A实验试剂 30

附录B实验仪器 31

第一章 综述部分

脂肪酶

1.1.1简介

脂肪酶（Lipase, EC 3.1.1.3）基本构成单位为氨基酸，活性中心具有亲核的Ser-His-Asp三联体。脂肪酶具有独特的界面效应，在接近无水的有机溶剂中保持高度催化活性、区域选择性以及热力学稳定性^[1]。

1.1.2脂肪酶的结构

一级结构具有序列Gly-X1-Ser-X2-Gly，其中X1为His或Gly，X2则一般为Met、Leu、Gla或Glu,这一保守序列的保守性在真菌中更强^[2,3]。但是二级结构都是相同的，并且都是α/β水解酶折叠^[4,5]。 脂肪酶的3D结构有两种构象，是根据底物是否存在分为“开”和“关”两种构象。其3D结构中有一个偶极性“盖子”，这个“盖子”含有疏水与亲水端，疏水端包埋在蛋白结构核心，亲水端朝向水环境。当有底物存在时，疏水端暴露在外面，此时处于“开”构象（图1-1b）。但当无底物存在时，亲水端就将代替疏水端暴露在外，脂肪酶处于“关”（图1-1a）的状态^[5]。

图1-1产于皱褶假丝酵母的脂肪酶，呈闭合（a）和开放构象（b），盖子呈黑色。在活性构象（b）中，酶活性位点可被底物所接近，这里由抑制剂（深灰色）表示，并由箭头突出显示^[5]

Figure 1-1. Lipase from Candida rugosa represented in the closed (a) and open conformation (b) with the lid depicted in black. In the active conformation (b) the enzyme active site is accessible to substrates here represented by an inhibitor (dark grey) and highlighted by the arrow^[5]

1.2关于脂肪酶的应用

自上世纪80年代，脂肪酶被发现在接近无水的有机溶剂^[6]中可以保持高度的化学、区域立体选择性。自此采用脂肪酶催化的手性拆分成为制备光学活性化合物^[7]的重要手段，部分生物催化应用列于表1-1。

表1-1部分生物催化应用实例

Tab.1-1 The examples of biocatalysis application

1.3.2.1 立体选择性水解

脂肪酶由于催化活性部位的大小口袋立体选择性仅会水解其中的一个构型生成脂肪酸和甘油，而另外一种构型仍以酯的形式存在。在制药领域，由外消旋萘普生甲酯通过假丝酵母脂肪酶不对称水解拆分得到的经典S-对映体非甾体抗

炎药萘普生^[14]，产物光学纯度达 98%，产率达 78%。此外，脂肪酶选择性水解二氢吡啶衍生物^[15]后获得的单一（S）构型化合可用于治疗心血管疾病，其中经CLAB脂肪酶水解的系列产物光学纯度高于94%，对映体选择率高于200。

图1-2脂肪酶手性拆分萘普生甲酯

Fig. 1-2 The resolution of naprosyn by candida rugosa lipase^[14]

1.3.2.2 立体选择性酯化

脂肪酶催化的不对称酯化反应可以通过使用合适的脱水试剂、分子筛或者沸石等严格控制反应体系中的水含量来改变拆分比例。例如：手性拆分外消旋薄荷醇反应^[16]在二异丙基醚体系中进行，通过脂肪酶甲基丙烯酸肟与左旋的薄荷醇进行选择性酯化，该反应具有较高的转化率（48%）和 eep 值（98%）。此外，以芳基丙酸衍生物^[17]如布洛芬（图1-3），酮洛芬和氟比洛芬等一类重要的非甾体抗炎药为例，只有S-对映体具有生物活性，因此工业上使用脂肪酶在流动系统中建立酶催化体系。

图1-3脂肪酶催化外消旋布洛芬对映选择性酯化

Fig.1-3Enantioselective esterification of racemic Ibuprofen with 1-propanol^[17]

在有机介质中，利用脂肪酶对消旋体2-卤羧酸消旋体进行手性拆分。利用脂肪酶拆分芳香酸(R,S)-2-(4-氯苯氧基)丙酸可制备光学纯的R 型对映异构体，一种有效的除草剂，目前该典型反应已经投入工业化生产^[18]。

1.3.2.3 立体选择性酯交换

Zhang YY等^[19]将底物乙基苯甲酸乙酯2-（苯基甲氧基）乙醛，1,4-二硫代-2,5-二醇和乙酸苯酯通过酶促反应一锅法合成光学纯的（R）-5-乙酰氧基-1,3-氧杂硫杂环戊-2-基,光学纯度（e.e.）为96.5% , 产率为97.3%,转化率达99.6%。

相较于伯醇和叔醇，脂肪酶活性位点在对仲醇拆分时有着更高立体选择性。光学纯的3-芳氧基-1,2-丙二醇（APPD）是一系列手性药物和农药前体化合物^[20]，其中（S）构型APPD被用于合成治疗心血管疾病如抗心律失常的药物普萘洛尔以及合成治疗心脏疾病的磷酸二酯酶抑制剂，而（R）构型APPD是合成昆虫生长调节剂的重要中间体。

图1-4固定化脂肪酶对3-芳氧基-1，2-丙二醇进行区域选择性乙酰化

Fig.1-4 Resolution of 3-aryloxy-1, 2-propandiols using immobilized lipase^[20]

脂肪酶的固定化

（1）传统方法

吸附法^[21]是酶与载体之间依靠范德华力、氢键和离子键等相互作用力来固定的方法，是固定化酶可操作性的重要理论依据，并且不需要严苛的化学反应，因此对酶的结构稳定性具有很重要的作用，通常和其它固定化方法连用。共价结合法^[22]是利用酶分子上的官能团与载体表面的基团共价结合来实现酶固定化的技术，使酶不易从载体上脱落,易从反应体系中回收且重复使用次数较多，但是因为发生了化学反应会造成酶构型的改变从而导致酶的失活。包埋法是用高分子半透膜或凝胶高聚物网格将酶包裹在一定区域的技术。底物可以通过网格进入载体中与酶接触。此操作方法条件温和，但是要求底物与产物可以穿过网格，适用于小分子的底物与产物。微囊化是包埋法的衍生，将水溶性或冻干酶、细胞通过二级乳化法包埋在直径为1~100μm 的半透性高分子膜内。交联法是酶与交联剂发生交联来实现固定化，交联剂具有双官能团或多官能团。交联法因酶与交联剂之间发生了化学反应。因此在满足实验要求的前提下，要降低交联剂的浓度与反应时间

（2）新兴方法

有以交联酶聚集体技术^[23]（Combined cross-linked enzyme aggregates，m-CLEAs）采用物理方法将酶蛋白聚集，然后使用交联剂将酶交联。在此技术中常用的交联剂为戊二醛。在固定化过程中，这种方法不需要使用惰性载体以及完全纯化的脂肪酶，只需将多个脂肪酶串联或者并联进行酶促生物转化。Arastoo Badoei-dalfard及其同事^[24]将Km12脂肪酶交联成酶聚合体后直接与氨基包覆的磁铁矿纳米颗粒偶联，制成的固定化酶在经过6次实验循环后，酶的生物活性基本无损失。

酶的“柔性固定化”^[25]使用具有一定长度以及一定亲水性的分子链通过化学接枝的方法将其固定在载体上。柔性固定缓解了酶与载体之间的刚性碰撞，当酶

蛋白结构因微环境的引导而改变时，酶可以保留适度柔性。Chao Chen及其同事^[26]指出聚多巴胺制备的新型Fe₃ O₄纳米颗粒通过二醛淀粉（Dial- dehyde starch）形成柔性间隔臂与酶结合，酶负载量高达242mg/g，同时保留了酶69％的比活性。

1.3.3 固定化载体

选择载体需要满足下面几个方面：第一，载体要具备活性官能团能够直接或间接实现载体与酶分子相互偶联；第二，载体的粒径、孔径以及吸附面积应与酶分子大小相匹配；第三载体要具有机械强度以及不溶于水，可以耐受化学溶剂以及微生物的腐蚀；最后要物美价廉。分子筛和多孔硅玻璃等作为传统固定化策略中常用的载体。

高性能的非均相官能化多孔聚合物^[27]属于纳米级别的材料，具有较大的表面积、稳定性高以及部分结构可以化学修饰等特点。二氧化硅、金刚石、石墨烯以及纳米碳管等载体材料相较于其它材料具有更高的敏感度以及更宽的检测范围。Hongbo Suo及其同事^[28]首次用离子液体（IL）改性的磁性壳聚糖（MCS）复合材料作载体壳。

金属有机骨架(MOF)^[29]通过类似于天然基质介导的生物-无机界面发生的生物矿化，可在蛋白质基水凝胶上自发形成。MOF有无机物与有机络合基团连接构成多空结构杂化晶体，具有大量的空隙可以提高酶与载体的结合。Christian Doonan及其同事^[29]采用了生物矿化策略将嗜热脂肪酶封装在ZIF-8中进一步证实了MOF生物复合材料在生物加工和生物制药输送方面的潜力。

纳米花型固定化酶^[30]是于水溶液中酶与无机盐晶体杂交共沉淀形成花瓣状的酶-无机纳米晶体复合材料。Ge及其同事^[31]首次控制缓冲溶液浓度制备出纳米花型固定化酶。Xiufu Hua及其同事^[32]将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)封装在花朵状形状的无机纳米晶体复合物中，其酶活比天然脂肪酶和商业化固定化脂肪酶Novozym435分别高出25倍和4倍。

1.4 3D打印技术与高分子聚乳酸材料

3D打印技术具有可以在较短时间内制备出具有复杂结构、多孔结构以及3D打印（3DP）比例模型或原型的潜力的优点。3D打印技术可以通过设计图纸在3D打印机上打印出载体，并且可以用过修改设计图纸来快速完成载体的修改^[33]。3D打印技术以快速进入生物领域，Boyang Huang及其同事^[34]制成的3D打印多孔支架纳米管与天然骨的纳米结构相似，且在机械性能，细胞增殖，成骨分化和支架矿化的等方面有所增强。

Narayanan LK及其同事^[35]将聚乳酸（PLA）,藻酸盐水凝胶与脱细胞的组织/器官细胞外基质组成的纤维生物墨水与3D打印相结合。封装于生物墨水内的人类脂肪干细胞可以承受在数字式驱动的制造过程中遇到的压力，继续成熟以及增殖，在第4周时可检测到成熟细胞外基质。

第二章 脂肪酶 YCJ01的定向固定化

2.1前言

脂肪酶是一种可以在离子液体、有机溶剂以及超临界流体等环境中发挥优秀性能的生物催化剂，并且可以催化多种类型的反应。为了避免游离酶在工业生产中产生不良影响，固定化酶可以有效提高利用率和降低生产中酶催化剂的成本。本文运用3D打印技术制备载体并采用化学法将疏水基团结合到聚乳酸表面，获得亲水亲油的载体。

2.2本次实验所需要的实验材料

2.2.1试剂

详情请见附录A

2.2.2仪器

详情请见附录B

2.2.3菌种来源

来源于菌株Burkholderia ambifaria YCJ01的脂肪酶YCJ01在NCBI的登记号 （GeneBank Accession Number）：JQ733583。重组脂肪酶YCJ01表达菌株E. coli BL21(DE3)/pET28a-NusA-YCJ01由本实验室自行构建并保存。

2.2.4培养基

LB固体培养基;种子培养基；发酵培养基。

注：以上均经灭菌后使用。

2.3实验方法

2.3.1脂肪酶YCJ01制备

取-80℃冻存的重组菌株NusA-lipaseYCJ01涂布于含卡纳抗性LB固体培养基上，在37℃下把其存放于恒温培养箱中预培养12h。随后在培养结束后从多个菌落中筛选出长势最好的，转入种子培养基中，于180 rpm和37℃恒温摇床中培养12h。将发酵完成的种子培养液2%（v%）接入发酵液摇瓶中，于温度37℃和180 rpm转速的摇床中。OD达到0.4~0.6时，加入终浓度1Mm的IPTG，对种子培养液中的菌落诱导，然后置于30℃和180rpm条件下进行诱导发酵6h。结束后，量适量体积的发酵液，然后将其在4℃和12000rpm下离心10 min，当完成离心后小心收集菌泥沉淀物后，舍弃离心瓶中全部上清，加入适量体积缓冲溶液（pH=7.5）制得菌体重悬液。在冰浴条件下，采用超声波破碎仪对重悬液进行10min破碎。将收集到的液体于4℃和12000 rpm下离心10min，收集上清液，随后将其放置在真空中冷冻干燥48h后，制得脂肪酶YCJ01酶粉。

2.3.2 3D载体设计

图2-1 3D打印支架A）（I）聚乳酸原料（II）固定化酶3D打印载体的简单反应器（III）反应器底部3D打印载体的低倍放大图像。 B）具有可调孔径结构的三种类型的打印支架：立方体，球形和半圆形。 比例尺在第一张图像中为2mm，在每组平行图像中为0.5mm。

Fig.2-1 3D-printed scaffolds A) (I) Original structure (II) An simple reactor with an enzyme-immobilized 3D-printed carrier (III) Image of 3D-printed carrier in reactor bottom with low- magnification. B) Digital images of 3D of three types of printed scaffolds: cube, sphere and semicircle

3D打印广泛用于工业设计和组织工程中。下列载体由3D Max2014软件完成，然后在3D打印聚乳酸(PLA) 载体, 具体的打印参数如图2-1所示。这种3D打印机的商业化成本已经低至399美元，实验中使用的3D支架的平均价格为0.033美元（每个支架约5克）。

2.3.3聚乳酸载体的表面修饰

2.3.3.1聚乳酸表面蚀刻与氨解

在酸性条件下，硅羟基与聚乳酸的反应生成Si-O-PLA键。碱性伯胺基团是与卤素或活性羰基发生通过亲核置换或者加成反应生成。通过上述过程引入了疏水性基团。为使载体表面环境提供恰当的柔性束缚。根据实验室前期工作可知，脂肪酶YCJ01对苯环有强烈的特异性吸附，因此商品型硅烷偶联剂和活性化合物筛选前提均为具有尾端苯环结构。

图2-2反应试剂结构及修饰后的代码

Fig. 2-2 The structure of agents and the corresponding codes after modification

Step1：将已完成PLA支架（10g±0.05g）浸没在装有60mL现配的食人鱼溶液（H₂SO₄:H₂O₂ 2:1）的圆底烧瓶(200mL）底部。在82℃油浴锅中和200rpm下恒温反应3h。在蚀刻结束后，使用蒸馏水洗涤支架三遍，然后放置于100mL圆底烧瓶中，随后加入含10mL乙酸、0.4g硫酸亚铁和28mL过氧化物的Fenton

反应液和2mL浓硫酸催化剂在72℃下恒温反应3h。载体表面已被修饰上大量羟基。

Step2：当羟基化修饰后，用超声清洗浸泡在蒸馏水中PLA支架30min，随后放入干燥箱烘干待用。将富含羟基的聚乳酸支架置于35mL75%乙醇中，在40℃条件下加入5mL12mg/mL的己二胺乙醇溶液，恒温反应5h。

2.3.3.2链接臂接枝反应

向100mL圆底烧瓶中加入30mL的100%乙醇，然后加入5g介孔SiO₂，用乙酸调节溶液，在溶液显弱酸性时，加入3-（苯基氨基）丙基三甲氧基硅烷（0.5mM）。调节温度为78℃时，通入氮气保护回流反应8h。结束后使用抽滤装置将载体与反应液分离，并用适量的乙醇洗涤沉淀物三次，随后将沉淀物放入烘箱（60℃，6h）进行干燥处理。活性氨基,在室温条件下于30mL无水乙醇中与苯甲醛, 酰氯乙苯和化合物反应6h；活性氨基与戊二醛反应后，用无水乙醇洗涤三次，加入苯胺，室温下搅拌5h; 活性氨基与苯丙酰氯化合物，在55℃条件下，加入含催化量MgSO₄的20mL无水乙醇中保温反应10h。用布氏漏斗将支架与反应液分离，分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤三次，在70℃下，把支架真空干燥12h，可得表面修饰的聚乳酸载体。所采用的化学修饰剂的结构以及修饰后的代码如图2-3。

2.3.4 固定化脂肪酶YCJ01的制备

将化学修饰后的聚乳酸颗粒通过特异性物理吸附使脂肪酶蛋白分子充分吸附到聚乳酸（PLA）载体表面以及设计的孔道中，成功实现了脂肪酶YCJ01的固定化。实验操作过程如下：分别称取无化学修饰和经化学试剂修饰后的聚乳酸载体100mg，置于 100mL烧杯中，随后用磷酸缓冲溶液（50mM pH 7.0） 稀释5mL脂肪酶粗酶液倒入摇瓶中。在35℃恒温摇床中，将装有初始上清酶活为25U/mL的摇瓶于180rpm转速条件下搅拌吸附 10小时后离心，收集上清，检测其酶活及蛋白浓度。其中的沉淀物用适量pH 7.0的磷酸缓冲洗涤，直到洗出液中无蛋白，然后在真空干燥（70℃，12 h）条件下将沉淀物干燥，制得固定化酶。

2.3.5 脂肪酶固定化酶学参数计算

（1） 脂肪酶活力测定

脂肪酶会可以与人工底物对硝基苯酚棕榈酸酯 (p-Nitrophenyl palmitate，pNPP)发生反应，水解产物为棕榈酸和对硝基苯酚(p-Nitrophenol，pNP)。因pNP在波长410nm处有最大吸收，所以脂肪酶活力可通过分光光度法定量测定反应过程中生成pNP的浓度，将所得数据作线性方程来计算。本论文采用国际酶活单位(U)，定义为在pH7.5，40˚C下,恒速搅拌反应体系时每分钟生成1 μmol pNP所需脂肪酶酶的量。

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