论文总字数：21258字

摘 要

Abstract 2

第一章 文献综述 3

1.1 关于漆酶 3

1.1.1漆酶的简介 3

1.2.2漆酶的氧化机理 4

1.2 固定化漆酶载体及技术研究进展 4

1.2.1 固定化漆酶载体 5

1.2.2 漆酶的固定化方法 6

1.3 漆酶降解污染物的研究 6

1.4 本课题的研究意义和研究内容 7

1.4.1 本课题的研究意义 7

1.4.2 本课题的研究内容 8

第二章 实验材料和方法 9

2.1 实验试剂 9

2.2 仪器设备 10

2.3 磁性纳米粒子Fe₃O₄的制备 10

2.4 氨基功能化离子液体对壳聚糖的改性 10

2.5 MACS-NIL纳米粒子的制备 11

2.6 MACS-NIL-Cu纳米粒子的制备 11

2.7 漆酶固定化 11

2.8 固定化漆酶对双酚A、吲哚、蒽的去除研究 11

2.9 载体的表征 12

第三章 结果与分析 13

3.1 表征分析 13

3.2 漆酶固定化结果 15

3.3 双酚A、吲哚、蒽的去除研究 16

第四章 总结与展望 17

4.1总结 17

4.2 展望 17

参考文献 18

致谢 22

摘要

漆酶作为生物催化剂，可降解多种有机污染物，在废水处理上有着极大地应用前景。本文以氨基功能化离子液体修饰的磁性壳聚糖共固定化2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)与漆酶，采用傅里叶变换红外光谱分析(FT-IR)和热重分析(TGA)表征载体，并通过电子顺磁共振分析(EPR)证实载体中ABTS同样发挥电子转移作用。在优化条件(pH 3.5；温度30^oC；酶浓度为0.6 mL漆酶溶液/mL)下固定化漆酶，酶负载量达到了47.1 mg/g，与游离漆酶相比，活性提高了65.6%。25^oC下，对比了固定化漆酶和游离漆酶对水中吲哚、双酚A、蒽的去除效果，在72 h内固定化漆酶可完全降解双酚A，对吲哚的降解率达到70.5%，对蒽的降解率提高至93.3%。通过对比游离漆酶，固定化漆酶不仅具有更好的酶学性能，而且对污染物的降解效果更好，并且能够实现固定化漆酶的快速有效回收。

关键词：漆酶固定化；磁性壳聚糖；离子液体；ABTS

Abstract

As a biocatalyst, laccase can degrade various organic pollutants and has great application prospects in wastewater treatment. This paper co-immobilizes 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) (ABTS) and laccase with magnetic chitosan modified by amino functionalized ionic liquid. The carrier is characterized by Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and thermos gravimetric analysis (TGA), then electron paramagnetic resonance analysis (EPR) confirmed that ABTS in the carrier also played a role in electron transfer. The laccase was immobilized under optimized conditions (pH 3.5; temperature 30^oC; enzyme concentration 0.6 mL laccase solution/mL). The enzyme load reached 47.1 mg/g, and the activity increased by 65.6% compared to free laccase. Under 25^oC, the degradation effects of indole, bisphenol A, and anthracene in water were between free laccase and immobilized laccase. bisphenol A could be completely degrade by immobilized laccase within 72 hours, and the degradation rate of indole and anthracene reached 70.5 % and 93.3%. By comparing with free laccase, immobilized laccase not only has better enzymatic performance, but also has better degradation effect on pollutants, and can achieve fast and effective recovery of immobilized laccase.

Key word: laccase immobilization; magnetic chitosan; ionic liquid; ABTS

第一章 文献综述

1.1 关于漆酶

1.1.1漆酶的简介

漆酶是一类含有多个铜原子的多酚类的氧化酶。首次发现可追回1883年，日本Yoshida从紫胶漆树分泌的汁液硬化发现，目前可从微生物、高等植物、白腐菌等菌类及昆虫等提取^{[1, 2]}。漆酶具有较高的催化能力，借助如ABTS等可扩散电子载体还可将底物范围扩大到氧化还原电位更高的化合物，因此其能作用的底物相当广泛，包括含羟基或胺基的芳烃类及其衍生物，类固醇激素和生物色素及其他非酚类物质如抗坏血酸，吲哚及其衍生物等^[3]，在食品加工、废水处理、染料脱色、农药降解等领域具有重要应用价值^{[4, 5]}。

图1-1 枯草芽孢杆菌漆酶活性结构示意图^[6]

上图是枯草芽孢杆菌漆酶的活性中心结构示意。漆酶的活性中心主要由四个铜原子所组成，T1型铜作为主要的电子受体，可使溶液呈蓝色，顺磁共振(ESR)检测表现为顺磁性，在λ600 nm处有明显的吸收峰出现；T1型铜在酶的表面有宽的空腔可以容纳底物，是底物电子进入催化位点的入口；同时T1型铜的还原限速^[7]。T2型和T3型铜紧密相连呈三环铜簇，其中T2型铜为单个铜中心，在可见区仅表现出弱吸收，ESR检测为顺磁性；T3型铜则由两个铜离子通过羟基连接构成，在λ330 nm处有吸收带，但因为两个铜原子反磁性耦合，ESR不能检测。T3型铜的两个铜离子呈三角形排列，有利于氧气结合，使得分子氧被消耗生成产物水^{[6, 8]}，因此该区域是漆酶氧化还原必不可少的一部分。

1.2.2漆酶的氧化机理

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