论文总字数：20700字

摘 要

青霉素作为全球首次在临床上使用的抗感染类药物，已成为一类被广泛运用的药物。青霉素在我国医药市场上的需求量日益剧增。青霉素酰化酶在目前的阶段中已经有了较广泛的研究成果，但由于青霉素酰化酶的不耐酸，高温易失活的特性而难以在工业化生产中发挥巨大作用，我们可以通过进一步深入研究青霉素酰化酶的结构，从而对青霉素酰化酶进行结构改造以开发可以应用与工业生产的高性能酶，这对实现通过青霉素酰化酶生产合成青霉素有着重要价值。

我们从实验室自行筛选的Achromobacter xylosoxidans来源的青霉素酰化酶PGApx02出发，对其进行定点结构改造，初步筛选得到高效合成氨苄西林的突变子，并对其进行合成条件的优化。主要研究工作如下：

1.通过查阅文献和将它的序列及结构的进行对比，确定决定PGApx02活性周围的关键部位，分析对青霉素酰化酶酶活影响最大的部位，确定对酶催化活性影响较大的突变位点。

2.选择其中最为关键的突变位点，进行饱和突变，筛选在氨苄西林合成中效果较好的突变子。对突变子的合成条件进行优化，包括反应温度、反应pH、底物浓度、底物摩尔比和加酶量。

3. 对从实验室自行筛选的Achromobacter xylosoxidans来源的青霉素酰化酶PGApx02的突变体βF24A在高底物浓度下合成氨苄西林的反应体系进行了优化，得到的理想反应条件为： 6-APA：D-PGME·HCl=600mM：660mM，加酶量为4ml发酵液，反应初始pH为5.9，反应温度为20˚C，纯水相体系。在此最适条件下，S/H值达到24.1，反应240min，氨苄西林的合成转化率达99.1%。

关键词：青霉素酰化酶 突变 氨苄西林

The synthesis of ampicillin by a mutant Penicillion G acylase

Abstract

As the world's first anti-infective drug used clinically, penicillin has become a widely used drug. The demand for penicillin in China's pharmaceutical market is increasing rapidly. Penicillin acylase has been widely studied in the current stage, but it is difficult for the penicillin acylase to play an important role in industrial production due to its acid-resistant and high-temperature deactivation characteristics. We can further study it further. The structure of the penicillin acylase thus structurally modified the penicillin acylase to develop a high-performance enzyme that can be applied and industrially produced, which is of great value for realizing the synthesis of penicillin by the production of penicillin acylase.

We started with the self-selected Achromobacter xylosoxidans-derived penicillin acylase PGApx02 from the laboratory, and conducted a site-directed structural transformation to obtain a highly efficient synthesis of ampicillin mutants and optimize their synthesis conditions. The main research work is as follows:

1. By consulting the literature and comparing its sequence and structure, determine the key positions that determine the activity around PGApx02, analyze the sites that have the greatest impact on the activity of penicillin acylase, and identify the mutation sites that have a greater impact on the catalytic activity of the enzyme. .

2. Select the most critical mutation site, perform saturation mutations, and screen for mutants that perform well in ampicillin synthesis. The synthesis conditions of the mutants were optimized including reaction temperature, reaction pH, substrate concentration, substrate molar ratio, and enzyme addition amount.

3. The reaction system for the synthesis of ampicillin at a high substrate concentration was optimized for the mutant βF24A of the Achromobacter xylosoxidans-derived amylinase PGApx02 from the laboratory itself. The ideal reaction conditions obtained were: 6-APA:D -PGME.HCl = 600 mM: 660 mM. The amount of enzyme added was 4 ml of fermentation broth, the initial pH of the reaction was 5.9, the reaction temperature was 20 ̊C, and the pure aqueous phase system was used. Under this optimal condition, the S/H value reached 24.1 and the reaction was 240 min. The conversion rate of ampicillin was 99.1%.

Key Words: Penicillion G acylase; mutant; ampicillin

目录

摘 要 Ⅰ

Abstract Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1 氨苄西林简介 1

1.2 青霉素酰化酶的简介 1

1.3 青霉素酰化酶的催化机制 2

1.4 青霉素酰化酶的稳定性 3

1.5 青霉素酰化酶的水解与合成特性 4

1.6.1 研究意义 4

1.6.2 研究内容 6

第二章 高底物浓度下制备β-内酰胺类抗生素 7

2.1 前言 7

2.2 实验材料 7

2.2.1 实验试剂 7

2.2.2实验仪器 8

2.3实验方法 8

2.3.1青霉素G酰化酶突变体的发酵条件 8

2.3.2 βF24A突变体合成氨苄西林初始反应体系 9

2.3.3初始反应pH对合成反应的影响 9

2.3.4温度对合成反应的影响 9

2.3.5 6-APA底物浓度对合成反应的影响 9

2.3.6底物摩尔比对合成反应的影响 10

2.3.7加酶量对合成反应的影响 10

2.3.8不同甘油浓度对合成反应的影响 10

2.3.9 βF24A突变体合成多种β-内酰胺类抗生素 10

2.4结果与讨论 11

2.4.1初始反应pH对氨苄西林合成的影响 11

2.4.2 温度对氨苄西林合成的影响 11

2.4.3 6-APA底物浓度对氨苄西林合成的影响 12

2.4.4 底物摩尔比对氨苄西林合成的影响 13

2.4.5 加酶量对氨苄西林合成的影响 14

2.4.6 不同甘油浓度对合成反应的影响 15

2.5本章小结 16

第三章 结论与展望 18

3.1 结论 18

3.2 展望 18

参考文献 19

致 谢 22

第一章 文献综述

1.1 氨苄西林简介

青霉素作为全球首次应用于临床的抗感染类药物，已成为广泛运用的一类抗菌药物。青霉素在我国医药市场上的需求量日益剧增。氨苄西林是一种抗菌谱广泛的抗生素，在市场中具有巨大的竞争潜力，作为一类半合成的广谱抗生素，在市场中有着巨大的竞争潜力。它同时能够拆分手性药物的并合成多肽，在这两方面也有不俗表现，在药品生产中有着大量应用。青霉素在我国医药行业中拥有举足轻重的地位，属于我国抗生素原料药产量的关键种类之一，现在每年生产量以吨计，总产量和需求量占世界的80%左右，生产技术水平上也已经接近发达国家，其本身拥有很强的潜力。

通过半合成方法首次合成的氨苄西林是一类抗菌谱相对较广的青霉素。氨苄西林与天然青霉素相比，由于其苄基上的氨基的吸电子特性而能够耐酸，而氨苄西林由于容易被酶水解导致其口服吸收的效果不高，不足之处是不耐酶[1]。氨苄西林作为氨基青霉素类，是半合成中的一种，耐酸，血药浓度和尿药浓度比口服要高，可以杀灭痰液中的细菌而发挥药效。氨苄西林的抗菌谱性与天然青霉素类似，主要用在治疗细菌引起的一些呼吸道、肠道和胆道感染以及脑膜炎球菌引起的脑膜炎等，尤其在肺炎的治疗中作用突出。对于革兰阳性及阴性菌如能引起化脓性炎症的链球菌、流感杆菌、肺炎链球菌、肺炎克雷白杆菌及大肠杆菌等都有比较好的效果。作为治疗感染性疾病常用的药物之一，它同时具有良好的抗菌的活性，体内分布较广，能够获得较满意的疗效[2]。

请支付后下载全文，论文总字数：20700字