论文总字数：22369字

摘 要

苯丙酮单加氧酶（Phenylacetone Monooxygenase,PAMO）是Baeyer-Villiger单加氧酶(Baeyer-Villiger Monooxygenase，BVMO)中的一种，具有良好热稳定性和立体选择性，主要用于合成酯类化合物。由于苯丙酮单加氧酶作为生物催化剂在各种合成应用中的不断增加，其在蛋白质工程上的研究也成为迫切的要求。本研究主要对在大肠杆菌中重组表达的苯丙酮单加氧酶（PAMO）的表达条件进行优化。从培养基、温度、表达时间及诱导剂浓度几个方面来探究酶蛋白表达的最佳条件。初步实验结果显示：苯丙酮单加氧酶在TB培养基中蛋白表达水平较高，且在温度为37℃、诱导时间为15h、诱导浓度为0.5％L-阿拉伯糖的条件下目的蛋白的浓度较其他条件下高， PAMO在该条件下表达水平较好。

关键词：苯丙酮单加氧酶 Baeyer-Villiger单加氧酶 大肠杆菌 考马斯亮蓝法 蛋白质表达最佳条件

Optimization of Expression Conditions of Phenylacetone Monooxygenase protein

Abstract

Phenylacetone Monooxygenase is a kind of Baeyer-Villiger Monooxygenase , which is of high efficiency and high selectivity. It is widely used in organic synthesis reaction to make lactones compounds. As a result of the increasing application of phenylpropanone monooxygenase as a biocatalyst in various synthetic applications, its research on protein engineering has also become an urgent requirement. However, it appears to be a lacking research on the expression of phenylacetone monooxygenase. In this study, the optimum conditions for protein expression were explored from the aspects of culture medium, temperature, time of PAMO expression. The aim of this study was to determine the expression of PAMO in Escherichia coli by measuring the target protein concentration expressed in the Escherichia coli with the method of Coomassie brilliant blue. The results showed that the expression level of phenylacetone monooxygenase protein was higher in TB medium, and the concentration of target protein was higher than that of other conditions under the conditions of 37℃, 15h and 5% L-arabinose for induction .Thus it can be seen that the expression of PAMO is best under such conditions.

Keywords: Phenylacetone Monooxygenase; Baeyer-Villiger Monooxygenase; E.coli; Coomassie brilliant blue ; Protein expression

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 苯丙酮单加氧酶概述 1

1.1.1 苯丙酮单加氧酶的总述 1

1.1.2 PAMO的来源 1

1.1.3 PAMO的结构特点及活性位点 2

1.1.4 PAMO的酶学性质 2

1.2 苯丙酮单加氧酶蛋白表达条件的优化 2

1.2.1 PAMO蛋白表达的影响因素 3

1.2.2 PAMO蛋白表达优化方案 4

1.3 该实验研究的意义 4

第二章 实验材料与设备 5

2.1 材料与仪器 5

2.1.1实验仪器 5

2.1.2 药品与试剂 6

2.2 实验所用菌株与酶 6

2.3 培养基与所用试剂 6

2.3.1 培养基及抗生素的配制 6

2.3.2 缓冲溶液及其他试剂的配制 7

第三章 实验方法 8

3.1苯丙酮单加氧酶在大肠杆菌中蛋白表达 8

3.1.1原理 8

3.1.2 培养基的配置及分装 8

3.1.3 菌种的复苏 8

3.1.4 菌液的接种 9

3.1.5 加诱导剂进行诱导 9

3.1.6 菌体的处理 9

3.1.7 蛋白凝胶电泳SDS-PAGE 10

3.2 考马斯亮蓝测目的蛋白浓度 11

3.2.1 考马斯亮蓝法原理 11

3.2.2 实验试剂及仪器 11

3.2.3 实验步骤 11

第四章 结果与讨论 13

4.1 蛋白质表达SDS-PAGE结果与分析 13

4.2 考马斯亮蓝测定结果与分析 14

4.3 结果与分析 16

第五章 结论与展望 18

参考文献 19

致谢 22

第一章 文献综述

1.1苯丙酮单加氧酶概述

1.1.1苯丙酮单加氧酶的总述

在过去十年中，生物酶在许多合成化学中的应用是极具有高效性和特异性的一类催化剂，并引起了人们的广泛关注。BVMO是强大的生物酶催化剂中最显着例子^[1]。BVMO主要通过活化碳碳单键达到增环作用从而生成一些需要的酯类化合物^[2]。Baeyer-Villiger单加氧酶由于自身良好的生物催化活性，已经成为单加氧酶类研究的重要目标。单加氧酶是通过直接加氧方式进行催化氧化反应的一类特殊的酶，基本原理其实是BVMO中两个氧原子的分配反应，一个参与了与底物中碳 - 碳键的结合反应，一个被用来生成水^[3]。常见的单加氧酶有环戊酮单加氧酶、环己酮单加氧酶和苯丙酮单加氧酶^[4]等。单加氧酶作为生物催化剂具有很多优点，例如：对反应容易发生无危险性、反应快速且污染小等优点。当然，生物酶催化剂也存在不足的方面，如反应条件要求苛刻，通常的催化反应需要在水介质中进行^[5]，催化反应后该酶的回收利用率比较低，生物酶在蛋白的重复表达上的知识仍然存在空缺等问题都有待研究和解决。

近年来，人们开始对新型Baeyer-Villiger单加氧酶展开更详细的研究 ，特别是在活性位点上的研究已经取得了重大进步^[6]。研究组主要通过它的晶体结构来探索BVMO的活性中心，并通过一系列催化反应来测定BVMO的催化机理和适合的底物范围。其中， 苯丙酮单加氧酶晶体结构的发现^[7]对PAMO的研究具有重要的意义。苯丙酮单加氧酶的结构是由黄素腺嘌呤二核苷酸结构域和还原型辅酶Ⅱ结构域共同构成，且活性位点夹在域界面之间^[8]。此外，最近的一项研究发现，使用互补的生物化学和结构实验，揭示了PAMO主要作为氧活化酶。到达活性位点内的催化中心的任何合适的底物反应^[9]。PAMO的具体结构、机理认识及其显著的稳定性使该酶成为潜在生物催化应用的靶标。

请支付后下载全文，论文总字数：22369字