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摘 要

苯丙酮单加氧酶（Phenylacetone Monooxygenase,PAMO）具有良好的热稳定性，能够催化Baeyer-Villiger单加氧反应生成脂或内脂，在有机合成中具有重要的应用。向包括杂环酮在内的酮,添加Baeyer-Villiger氧化和动态动力学拆分，非常有希望作为合成路线扩增该反应。这些重要的反应产生使化学家感兴趣的合成环化产物。结构分析和催化机理研究发现，由于PAMO 的底物范围有限，仅限于催化芳香族酮类的单加氧反应，目前针对PAMO的研究主要集中在拓展该酶的底物范围和提高其催化效率。本课题主要研究PAMO及其四种突变体对环己酮的活性。

关键词: 苯丙酮单加氧酶; 生物催化； 底物范围；酶突变体； 环己酮；

Study on Substrate Range of Benzoacetone Monooxygenase in Biocatalysis

Abstract

Phenylacetone Monooxygenase (PAMO) has good thermal stability and can catalyze the Baeyer-Villiger single-oxygen reaction to produce lipid or lactone, which has important application in organic synthesis. The addition of Baeyer-Villiger oxidation and dynamic kinetic resolution to ketones, including heterocyclic ketones, is very promising to amplify the reaction as a synthetic route. These important reactions produce synthetic cyclization products that are of interest to chemists. Structure analysis and catalytic mechanism studies have found that PAMO's research is mainly focused on expanding the substrate range of the enzyme and improving its catalytic efficiency due to the limited range of PAMO substrate and limited to single oxygenation of aromatic ketones. This study focused on the activity of PAMO and its four mutants on cyclohexanone.

Keywords: Phenylacetone Monooxygenase; Biocatalysis; Substrate scope; Enzyme Mutant; Cyclohexanone;

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1研究背景及意义 1

1.2 Baeyer-Villiger 单加氧反应 1

1.2.1 Baeyer-Villiger 单加氧酶 2

1.3苯丙酮单加氧酶（PAMO）催化的Baeyer-Villiger反应 2

1.3.1 PAMO的简介 2

1.3.2 PAMO的结构特点和活性位点 2

1.3.3 PAMO的酶学性质 3

1.3.4CHMO与PAMO的区别 4

1.3.5PAMO的应用. 4

1.3.6 PAMO催化的Baeyer-Villiger反应 5

1.4定向进化技术拓展PAMO底物范围 5

1.4.1PAMO的改造. .5

1.4.2定点突变原理 5

1.4.4定点突变的应用 6

1.5底物环己酮转化为ε-己内酯 6

1.5.1意义 6

1.6实验内容 6

第二章 实验材料与设备 7

2.1 实验材料 7

2.2实验主要仪器 7

2.3 实验主要试剂 7

2.4准备工作 8

2.4.1使用试剂的配制 8

2.4.2质粒的提取 8

第三章 实验方法 10

3.1构建含有PAMO基因的表达数组 10

3.1.1大肠杆菌感受态细胞的制备 10

3.2 转化 11

3.3蛋白的表达及产物的提取 11

3.4蛋白凝胶电泳SDS-PAGE 12

3.5 气相 13

第四章 结果与分析 14

4.1 蛋白质表达SDS-PAGE结果与分析 14

4.2气相测试BV反应活性 15

第五章 结论与展望 19

参考文献 20

致谢 24

第一章 文献综述

1.1 研究背景及意义

1.1.1简介

Baeyer-Villiger 单加氧反应能完成对功能基的转化,是一种普遍运用于各类有机合成的氧化反应，并活化C-C键并将其环扩张，进而合成一系列有价值的酯类和内酯化合物^[1]。（图示1-1）Baeyer-Villiger 氧化反应可以控制产物的空间结构， 对极性基团在有机合成和成环反应中的转化具有重要的作用。

图1-1. Baeyer-Villiger 氧化反应

1.2.Baeyer-Villiger单加氧反应催化剂

用于Baeyer-Villiger单加氧反应的催化剂种类很多，起初使用的是一些有机过酸，这类氧化剂毒性大，会造成重污染，且成本高，不易于保存。[1] 考虑到对环境的影响，科学家又发现了一类均相催化剂，过渡金属氧化剂及贵重金属配体，这类催化剂具有高效，选择性高的特点，且产物是水和一些无污染的无机物，对环境没有污染。不过由于其所需反应条件过于严格、成本偏高，所以不便应用Baeyer-Villiger 反应。这类催化剂转化率很低，但是他能在反应之后，能与产物分离，可以回收再利用，减少资源损失同时也减少了研究成本。随着科技进步，科学家们发现了一类高效、高选择性、低污染、低损耗的生物催化剂——Baeyer-Villiger 单加氧酶类（BVMOs）。^[36]

单加氧酶，是一类转化有一些分子物质加氧的酶催化剂，所以又被称为加单氧酶。它的反应催化机理是让底物与转化化有机分子中一个氧原子进行反应，从而使另一个氧原子被反应还原成水。常见的单加氧酶有CPDMO、CHMO、CPMO和PAMO。单加氧酶具有反应速率快、反应状态平缓、反应条件正常等特点，且催化的效果具有高立体选择性，所以可以作为生物催化剂，对于一些手性药物中间体以及精细化学品的生物催化合成有非常显著的作用，对于水污染、大气污染等，影响微乎其微。单加氧酶的应用越来越广泛。^[37]当然，生物酶催化剂仍存在一些不足，比如反应条件如pH、温度等，需要严格控制，通常催化反应需要在非水介质中进行，反应后催化剂不能回收等问题，还有待进一步研究和发展。^[35]

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