论文总字数：22058字

摘 要

大肠杆菌由于具有明朗的遗传方式、生长时间短，操作简便等特点而被用作常用的受体细菌来进行外源蛋白的表达，然而，由于缺乏有助于蛋白质折叠的酶或辅助因子。导致了蛋白质的错误折叠产生了包含非活性聚合物。虽然已经开发了很多的方法来弥补它们的缺点，但外源靶蛋白的表达仍然是一个问题。融合标签是蛋白质表达和纯化的常用工具，同时也是解决大肠杆菌自身缺陷的重要方法。

β-呋喃果糖苷酶（Ffase）具有高效分泌与折叠能力，故推测能将其开发成新型融合标签帮助蛋白折叠。基于本实验室前期研究，开发了一种新型融合标签，与大肠杆菌中包涵体中表达的白介素21（IL-21）融合后，预计可达到可溶性表达。 结果表明，与Ffu312融合后约81％的靶蛋白以可溶形式表达，但当单独表达时几乎不表达，在融合了Ffu312后，可溶性蛋白比例最高到70%，可溶性表达量也最高为0.29g/L，因此，我们选择Ffu312作为融合标签融合白介素21蛋白作进一步的优化研究，通过对诱导剂种类和用量的优化，最终选择乳糖诱导，0.2g/L作为诱导剂，30℃诱导6h得到可溶性蛋白比例高达81%，可溶性蛋白量达到0.72g/L。

关键词： 融合标签 白介素21 可溶性表达 大肠杆菌

The efficient expression strategy of the Chlamydia pneumoniae out membrane protein

ABSTRACT

Escherichia coli because of a clear genetic way, short growth time, easy to operate , is widely used, and has become the most popular expression platform. However, some bottlenecks exit when it was established for expressing soluble proteins from other organisms, like poor growth of the host, inclusion body (IB) formation, protein inactivity, and so on. Several efforts have been taken to conquer the limitations，including the use of fusion partner that improves proteins expression and solubility.

Highly efficient secretion was achieved in the expression of β-fructofuranosidase in E.coli, which make it possible to be developed as novel fusion tags. According to early research achievement, Truncated Ffase were highly soluble and secretory proteins, one truncated Ffase were fused to Chlamydia pneumoniae out membrane protein (IL21) in order to promote its solubility in E.coli. The results show that total expression of IL21 was improved after fusing truncated Ffase fusion tag Ffu312 to IL21, while almost no soluble protein was detected without fusion tag Ffu312. 81% of soluble protein and 0.72 g/L fusion protein were achieved at 30 ℃ after 6h induction by 0.2 g/L lactose. Purified IL21 can be applied in pharmaceutical research after purification by nickel column and enterokinase digestion.

Key Words: fusion tag ;Interleukin 21;solubility;Escherichia coli

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第1章 文献综述 1

1.1 白介素21简介 1

1.2 大肠杆菌中表达的问题 1

1.3 融合标签技术概述 2

1.3.1 增溶性融合标签 3

1.3.2 纯化型融合标签 6

1.4 本课题研究的意义与内容 8

第2章 Ffu312增溶融合标签的构建 9

2.1 前言 9

2.2 材料与仪器 10

2.2.1 菌株与质粒 10

2.2.2 实验材料 10

2.2.3 主要仪器设备 11

2.2.4 培养基 11

2.3 实验方法 13

2.3.1 融合标签表达载体Ffu312的构建 13

2.3.2 大肠杆菌感受态制备 14

2.3.3 重组质粒的转化 15

2.3.4 重组子的筛选与测序 15

2.3.5 重组菌的表达和细胞破碎 15

2.3.6 SDS-PAGE蛋白电泳 15

2.4 结果与讨论 16

2.4.1 融合蛋白表达载体Ffu312的构建 16

2.4.2 白介素21融合表达 17

2.5 本章小结 18

第3章 结论与展望 20

3.1 结论 20

3.2 展望 20

参考文献 21

致 谢 23

第一章 文献综述

1.1 白介素21简介

白细胞介素21是通过激活的CD4T 细胞产生的新型I类细胞因子，同时含有特异性白细胞介素21受体（IL-21R）和通用γ亚单位的复合受体链。 IL-21在免疫和非免疫细胞中的表达可以通过细胞的活化或分化来调节。 通过IL-21R和JAK-1激活以及3 / Stat级联途径的组合; IL-21可以激活磷脂酰肌醇3激酶/ AKT信号通路和MAPK家族成员如细胞外信号上皮细胞，肿瘤细胞和单核细胞调节蛋白激酶。IL-21通过上述途径的激活直接完成其具有广泛的生物学功能，主要用于免疫功能，其中最显着的特征是放大T细胞和激活的NK细胞，B细胞的作用，显着调节 CD4 T细胞活性。 IL-21和IL-21R在调节巨噬细胞，滑膜细胞的活性中也是必不可少的。

而且白介素21在人体内也被发现广泛存在，人 IL-21 蛋白由 162 个氨基酸组成，结构上类似于IL-4和IL-15，由淋巴细胞产生，对肿瘤具有免疫反应，是人体免疫的重要一环。某些数据表明，类风湿性关节炎患者的外周血单核细胞及哮喘模型中被发现IL-21 的不正常形态。因此，抗 IL-21 的抗体通过反抗 IL-21 的生理功能来治愈肠炎、类风湿性关节炎和哮喘等自身免疫性疾病。在肿瘤这一困扰全人类的恶性疾病中也有具大的作用，可以通过辅助作用，大大的增强抗肿瘤免疫治疗的效果，例如，在小鼠乳腺癌和结肠癌的免疫治疗过程中，IL-21可以增加CD8 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的增殖，增强对肿瘤细胞的细胞毒性;在用人树突状细胞(DC)诱导产生的抗自体黑色素瘤CTL中, IL-21可以成10倍增加CTL的增殖及活性^[2]。。

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