论文总字数：18528字

摘 要

低聚乳果糖(O-β-D-galactopyranosyl-(1,2)-β-D-fructofuranoside)是由半乳糖、葡萄糖和果糖组成的一种三糖。作为一种功能性低聚糖，它具有热量低、难消化、可调节肠道等等一系列的生理功能。国内对于低聚乳果糖的研究比较晚，目前还未有量化生产的报道。目前果糖苷酶在低聚乳果糖的工业生产上存在着不小的困难：首先天然的β-呋喃果糖苷酶的产源众多各不相同，其本质上是一种水解酶，在低聚乳果糖酶法合成中最关键的是如何获得一种活力比较高的酶； 其次是游离酶在生产时无法反复使用，导致成本过于昂贵，且后期酶与产物不能很好的被分离。因此，新型果糖苷酶催化生成低聚乳果糖的开发以及固定化作用可为低聚乳果糖量化生产提供指导。

本课题用Ɛ-聚赖氨酸修饰过的Fe₃O₄磁性纳米颗粒为载体，对β-呋喃果糖苷酶进行交联固定化，大大提高了酶的利用率以及固定化酶的回收重复使用。

实验得果糖苷酶最适固定化温度为 25°C，最适固定化 pH 为 6.5，此时得到固定化的果糖苷酶，酶活力为57.4U/g，酶活回收率为55.7%。

关键词：β-呋喃果糖苷酶 Ɛ-聚赖氨酸 Fe₃O₄磁性纳米颗粒 戊二醛交联

Cross-linking immobilization process of β-fructofuranosidase

Abstract

Lactosucrose (O-β-D-galactopyranosyl-(1,2)-β-D-fructofuranoside) is kind of trisaccharide which consists of galactose, glucose and fructose. As one of the most important functional oligosaccharides, it has a range of physiological functions, such as low calorie and indigestible. Lactosucrose is selectively utilized by intestinal bifidobacterium, therefore it can promote the bifidobacterium proliferation and inhibit the growth of pathogenic bacterium, and it can regulate the intestinal tract. Lactosucrose has been researched for several years, but its industrialization has never been reported in China. It exists some challenge that using the β-D-fructofuranosidase (β-FFase) for industrialization:On one hand, β-FFase, a kind of hydrolytic enzyme, can be found in nature, but it is hard to obtain obtain β-FFase with high transfructosylating activity; On other hand, the free enzyme can not be reused and also hard to separate from the product. So, to develop a novel β-FFase and a practicable methods for β-FFase immobilization is of great significance for the lactosucrose industrialization.

In this study, the β-fructofuranoside was immobilized on Fe₃O₄ magnetic nanoparticles modified by Ɛ-PL. This experiment greatly improving the utilization of enzymes and the recovery of immobilized enzyme.

The optimum immobilization temperature of β-fructofuranoside was 25°C. And the optimum immobilization pH was 6.5. At this time, the enzyme activity of immobilized β-fructofuranoside was 57.4U / g, and the recovery rate of enzyme activity was 55.7%.

Key Words: β-fructofuranoside; Ɛ-PL; Magnetic Fe₃O₄ nanoparticles; Glutaraldehyde

目 录

摘 要 I

Abstract II

目 录 III

第一章 文献综述 1

1.1 酶的固定化技术 1

1.1.1传统的载体固定化酶技术 1

1.1.2新型载体酶固定化方法 1

1.2 β-呋喃果糖苷酶 1

1.3 β-呋喃果糖苷酶的固定化研究进展 2

1.4研究意义 3

第二章 β-呋喃果糖苷酶的交联固定化 4

2.1实验材料 4

2.1.1 LB培养基 4

2.1.2实验材料与试剂 4

2.2实验原理 5

2.2.1 Fe₃O₄磁性纳米颗粒为载体 5

2.2.2 Ɛ-聚赖氨酸(Ɛ-PL) 5

2.2.3 ƐPL- Fe₃O₄制作 5

2.2.4戊二醛的交联固定化 5

2.3实验方法 6

2.3.1果糖苷酶的制备与测定 6

2.3.2磁性 Fe₃O₄ 纳米颗粒的制备 7

2.3.3 Ɛ-PL修饰 7

2.3.4固定化果糖苷酶的制备 8

2.3.5戊二醛交联 8

2.4结果与讨论 8

第三章 固定化条件优化与固定化酶的酶学性质 9

3.1温度对β-呋喃果糖苷酶的影响 9

3.2 pH 对β-呋喃果糖苷酶的影响 9

3.3时间对β-呋喃果糖苷酶的影响 10

3.4戊二醛对β-呋喃果糖苷酶的影响 11

3.5关于最适合固定化酶作用的温度与温度稳定性的实验 12

3.5.1 固定化酶的最适反应温度 12

3.5.2 固定化酶的温度稳定性 13

3.6关于最适合固定化酶作用的pH与pH稳定性的实验 14

3.6.1固定化酶的最适 pH 14

3.6.2 固定化酶的 pH 稳定性 14

3.7固定化酶的重复使用性 15

3.8 本章小结 16

参考文献 18

致 谢 20

第一章 文献综述

1.1 酶的固定化技术

固定化酶技术是指用物理或者化学方法，把原本水溶性的游离酶封锁在固定材料里或约缚在特定范围内实施活跃的、特有的催化反应，且能够回收再利用的一种技术。酶的固定化技术目前是酶应用区域中一个重要的科研焦点。相对于普通游离酶而言，固定化酶具有稳定性高、方便控制、价格合理、回收便利、重复利用率高等众多优势。在生物工业、化学分析、能源开发、环境保护、医学及临床诊断以及基础研究等方面发挥了重要作用[19]。

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