论文总字数：18951字

摘 要

脂肪酶作为一种常见的生物催化剂，在生物催化中有许多重要应用。然而将脂肪酶真正应用于大规模生产应用也存在一定的挑战。本实验以聚四氟乙烯管作为微通道，通过多巴胺的自聚合反应，对聚四氟乙烯管进行修饰，使其表面带有可反应的氨基和醌基，然后聚乙烯亚胺交联剂（PEI）与其反应吸附于微通道内，再将脂肪酶CAL-b通过静电吸附固定在通道内，这样将PEI交联剂和脂肪酶层层吸附8层。实验研究结果显示：微通道固定化酶过程中，随微通道内脂肪酶吸附层数的增加，酶蛋白吸附量及酶活呈明显上升趋势。实验采用比色法，测定不同条件下的酶活性，发现游离脂肪酶的最适pH为7.0，最适温度为40℃，且其pH稳定性和温度稳定性较差；而微通道固定化脂肪酶的最适pH为8.0，最适温度提高到60℃，且其pH和温度稳定性有较大提高。

关键词：脂肪酶 固定化酶 微通道

Micro channel inner layer adsorption immobilized lipase

Abstract

As a kind of common biological catalyst, lipase has many important applications in biological catalysis. However, there are some challenges in the large scale production of lipase.In this experiment, the PTFE tube was used as the micro channel.Through the self polymerization of dopamine, so that the PTFE tube with amino and quinone group .Then the crosslinking agent (PEI) was reacted with the reaction and adsorption to the micro channel.And then the lipase CAL-b was adsorbed on PEI.These two steps are repeated eight times. The experimental results showed that the adsorption amount and lipase activity showed a significant upward trend with the increase of the number of lipase in the micro channel. The activity of lipase was determined by colorimetric method.It was found that the optimum pH of free lipase was 7, the optimum temperature was 40 degrees Celsius, and the pH stability and temperature stability was poor.And It was found that the optimum pH of the immobilized lipase was 8, the optimum temperature was 60 degrees Celsius, and the pH and the temperature stability of the immobilized lipase were higher.

KEYWORDS: Lipase ; Lmmobilized enzyme ; Micro channel

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 脂肪酶 1

1.1.1 脂肪酶的简介 1

1.1.2 脂肪酶的结构及催化机理 1

1.1.3 脂肪酶应用的不足 1

1.1.4 脂肪酶CAL-b的简介 2

1.2 固定化酶 2

1.2.1 固定化酶的简介 2

1.2.2 固定化酶的优点 2

1.2.3 酶固定化方法 2

1.2.4 固定化酶载体 3

1.3 微通道 4

1.3.1 微通道的概述 4

1.3.2 微通道反应器的制作材料 4

1.3.3 微通道反应器的优点 5

1.3.4 微通道反应器在生物催化中广泛应用 6

1.4 多巴胺 6

1.4.1 多巴胺的简介 6

1.4.2 多巴胺的结构 6

1.4.3 多巴胺的应用 6

第二章 实验材料和方法 8

2.1 实验材料与仪器 8

2.1.1 实验材料 8

2.1.2 实验试剂 8

2.1.3 实验仪器与设备 9

2.2 开管式微通道固定化脂肪酶的制备 9

2.2.1 Tris-HCl 缓冲的配制 9

2.2.2 多巴胺盐酸盐溶液的配置 10

2.2.3 脂肪酶CAL-b酶液和聚乙烯亚胺交联剂的配置 10

2.2.4 开管式微通道固定化脂肪酶的制备 11

2.3 考马斯亮蓝法测定吸附脂肪酶的酶量 11

2.3.1 标准曲线的绘制 11

2.3.2 考马斯亮蓝法测定吸附脂肪酶的酶量 11

2.4 游离脂肪酶和开管式微通道固定化脂肪酶的酶活测定 12

2.4.1 标准曲线的绘制 12

2.4.2 游离脂肪酶酶活的测定 12

2.4.3 开管式微通道固定化脂肪酶酶活的测定 12

2.5 游离脂肪酶和开管式微通道固定化脂肪酶的酶学性质测定 13

2.5.1 最适温度的测定 13

2.5.2 最适pH的测定 13

2.6 游离脂肪酶和开管式微通道固定化脂肪酶的稳定性测试 13

2.6.1 温度稳定性的测试 13

2.6.2 pH稳定性的测试 13

第三章 实验结果与讨论 14

3.1 层层吸附过程中酶蛋白吸附量的变化 14

3.2 层层吸附过程中酶蛋白活性的变化 15

3.3 游离脂肪酶和开管式微通道固定化脂肪酶的酶学性质比较 16

3.3.1 最适温度的比较 16

3.3.2 最适pH的比较 17

3.4 游离脂肪酶和开管式微通道固定化脂肪酶的稳定性比较 18

3.4.1 温度稳定性比较 18

3.4.2 pH稳定性比较 19

第四章 结论 20

参考文献 21

致 谢 23

文献综述

1.1 脂肪酶

1.1.1 脂肪酶的简介

脂肪酶的全称为三脂酰甘油酰基水解酶，国际酶学委员会的编号为EC3.1.1.3^[1]。脂肪酶是一类重要的催化酯水解及合成的酶，是一种有高度专一性、催化效率较高专的生物催化剂。

1.1.2 脂肪酶的结构及催化机理

目前，已经大约有2000种脂肪酶被分离纯化出来，并且人们通过现代科技确定了脂肪酶的结构^[1]。脂肪酶的催化活性三元组大多数情况下是由一个丝氨酸、一个天冬氨酸和一个组氨酸组成，不同类型的脂肪酶分子具有较为相似的立体结构，但是氨基酸序列差别比较大，多样性比较高，但它们的分子结构有两个相同的特征：第一它们的活性中心为丝氨酸残基；第二它们含有同源区段：His-X-Y-Gly-Z，Ser-W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly（其中X、Y、W、Z代表可变的氨基酸残基）^[2]。同时，脂肪酶的催化活性位点上方一般有一个“盖子”，而正是由于这个“盖子”，所以脂肪酶表现有界面活性^[2]。

1.1.3 脂肪酶应用的不足

脂肪酶在实际应用中存在一定问题^[3-5]，主要有以下四个方面：

1. 游离脂肪酶稳定性较差，在反应中容易受pH、温度等外界环境因素的影响，导致脂肪酶活性降低；
2. 游离脂肪酶在反应中溶于反应体系过程后，故反应结束后难以回收利用；

（3）反应若在非水的溶剂体系中进行，则游离脂肪酶不易溶解而易发生聚集现象，导致酶的利用率较低；

（4）在某些催化反应，其反应底物不溶于水，为解决这个问题，需要加入合适的溶剂或乳化剂来溶解底物，而这种操作不利于酶的回收利用，且降低产率。

1.1.4 脂肪酶CAL-b的简介

南极假丝酵母可以产生两种脂肪酶：南极假丝酵母脂肪酶A（CAL-a；Candida antarctic lipase A）和南极假丝酵母脂肪酶B（CAL-b；Candida antarctic lipase B）。其中，由于CAL-b的催化活性比较高，故其在实际反应中的应用越来越多。

1.2 固定化酶

1.2.1 固定化酶的简介

酶的固定化技术是将游离酶与不溶于反应体系的固体材料相结合，使得游离酶只能在一定范围内进行反应，从而改善游离酶的缺点^[6-7]。目前，对于酶固定化技术的研究正在逐步发展，新型的固定化酶越来越多，并在医药行业、化工行业、环境分析行业、食品行业析等多个行业得到广泛应用。

1.2.2 固定化酶的优点

1. 固定化酶在实际应用过程中不会溶于反应溶液中，反应结束后可以通过过滤、离心等手段将其与反应体系分离，可以有效控制酶的反应过程及提高反应产率。

(2)固定化酶在反应过程中不溶于反应体系，反应结束后对于酶的回收过程较为简便，从而提高酶的利用率。

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