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摘 要

斑马鱼作为药物筛选与活性评价模型已有逾20年的应用历史。斑马鱼与人类在基因组上具有高度保守性与相似性。斑马鱼胚胎在受精3天内是透明的，胚胎生长发育迅速，母体单次产卵量高，这些优势均为研究人员提供了便利。转基因斑马鱼（fli-1:EGFP）的血管内皮细胞能够稳定表达绿色荧光蛋白，方便研究人员实时动态地观察到斑马鱼胚胎血管新生的完整过程，使其在血管新生研究中备受关注。

血管新生是指机体在原有基础上长出新血管的过程，在很多疾病治疗中，扮演着重要角色。促进血管新生能够改善微循环，为缺血性疾病，如动脉硬化闭塞症、冠状动脉硬化性心脏病等提供了新的治疗策略。

岩白菜素是来源广泛的天然化合物，已有的研究表明其具有止咳祛痰、抗炎、护肝、调节免疫等药理活性。本课题选用转基因斑马鱼模型，研究岩白菜素（B0）及其衍生物B1-B10对VRI造模损伤的斑马鱼血管新生的作用并验证其可能的分子机制。结果表明：岩白菜素（B0）母核在100μM以下不产生促血管新活性，其8、10位羟基衍生物（B1-B10）在不同程度上均表现出促血管新生活性，其中岩白菜素衍生物B4在600nM VRI诱导的血管损伤模型中促进血管生成活性最好，并显示出剂量依赖性；qRT-PCR验证结果显示，岩白菜素衍生物B4可能主要通过上调促血管生成素-2受体(tek)和VEGFR2(kdr)的表达，产生了血管恢复生长的活性。

关键词：转基因斑马鱼 血管新生 岩白菜素衍生物

Based on zebrafish model to evaluate bergenin derivatives

angiogenesis promotion

Abstract

Zebrafish as a model for screen and evaluation of pharmacological activity have been developed in the past 20 years.The genome of zebrafish is highly conserved and similar to humanity.The embryos are transparent in the first three days with rapid growth rate and easily to be observed.These advantages provide a great convenience for the researchers to improve efficiency and throughput of screening.The vascular endothelial cells of transgenic zebrafish(fli-1:EGFP) can express green fluorescent proteins that make the vascular network can be seen by fluorescent microscopy.In recent years,transgenic zebrafish model has been widely applied in angiogenesis research.

Angiogenesis is a process of new vessels sprouts out from the existing ones, involving complex procedures.It plays an important role in the treatment of many related diseases.Pro-angiogenesis can improve microcirculation,which could develop new therapeutic strategies for ischemic diseases,such as arterial occlusive disease and coronary atherosclerotic heart disease.

Bergenin is a common natural product from many kinds of plants.It has been used in clinical as expectorant and antitussive in the Chinese Pharmacopoeia.In recent years,bergenin has also shown pharmacological effects of anti-inflammatory,liver protection,immune regulation.In this study,we use the transgenic zebrafish (fli-1:EGFP) model to evaluate the pro-angiogenesis effects of bergenin(B0) and its modified derivatives(B1-B10).We found that in the 600nM VRI-induced vascular injury zebrafish model,bergenin derivative(B4) was the best one to promote angiogenesis in a dose-dependent manner.The result of qRT-PCR revealed that B4 may increase the expression of angiopoietin-2 receptor(tek) and VEGFR2(kdr) to promote angiogenesis and help rebuild the injured vessels.

Keywords: transgenic zebrafish; Angiogenesis; Bergenin derivatives

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 综述 1

1.1岩白菜素衍生物的研究进展 1

1.1.1母核简介 1

1.1.2岩白菜素的药理活性及应用 2

1.1.3已报道的岩白菜素衍生物 3

1.1.4岩白菜素衍生物已有的药理活性研究 4

1.2血管新生在药物研发中的地位 4

1.2.1血管新生与疾病的关系 4

1.2.2血管新生的筛选模型 5

1.2.3与血管新生调控相关的机制简介 6

1.2.4正在临床研究与已上市的血管新生调节药物及其应用 7

1.3转基因斑马鱼在血管新生药物筛选中的应用 8

1.3.1斑马鱼作为药物筛选模型的优势 8

1.3.2转基因斑马鱼的产生和特点 9

1.3.3转基因斑马鱼在血管新生促进剂的筛选与机制研究中的应用 10

第二章 应用转基因斑马鱼模型对十个岩白菜素衍生物促血管新生活性进行评价 11

2.1药物简介 11

2.2实验材料与仪器 12

2.2.1实验材料 12

2.2.2主要实验溶液和药物的配制 13

2.2.3斑马鱼胚胎的培养 13

2.3血管受损模型实验方法 13

2.3.1转基因斑马鱼VRI导致血管受损模型的建立 13

2.3.2药物处理 14

2.3.3表型观察及数据处理 14

2.4实验结果与讨论 15

2.4.1 B-0对转基因斑马鱼血管新生促进活性结果 15

2.4.2 B1-B10对转基因斑马鱼血管新生促进活性结果 16

2.4.3 B-4对转基因斑马鱼血管新生促进活性结果 18

第三章 岩白菜素衍生物B-4对斑马鱼血管新生调控相关基因的RT-PCR验证 21

3.1实验内容 21

3.1.1实验方法与基因序列 21

3.1.2实验步骤 22

3.2数据分析 24

3.2.1 qRT-PCR实验结果 24

第四章 总结与讨论 26

参考文献 27

致谢 30

第一章 综述

斑马鱼体积小，生长迅速，产卵量大且常年持续繁殖，胚胎透明，便于观察，在信号转导途径，形态和生理与哺乳动物都非常相似。与低等模式相比，其具有丰富的生物结构，对外界刺激反应敏感。这些独特优势使斑马鱼受到了研究者的亲睐，成为人类研究疾病和筛选活体高通量药物的最佳模型之一。

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