论文总字数：16047字

摘 要

本论文研究的目的是建立一种更加稳定、可靠的分析血样内源性代谢物的方法，使代谢组学的无偏向分析更加全面。本实验建立了以GC/TOF-MS为基础的大鼠血样代谢组学的方法，并用以研究绝经后骨质疏松症脂质代谢异常情况。术前及术后采集血清和血浆样品，测定BMD、B-ALP、NTx、OPG和RANKL等指标。采用PLS-DA分析方法分析GC-TOF/MS数据内在的相似性和关联性。从所得的色谱图中，鉴别了胆固醇，花生四烯酸，正十二烷酸，9-(Z)-十六碳烯酸，十六烷酸，油酸，甘油，正十二烷酸，十八烷酸，亚油酸，十八碳二烯酸等差异化合物。通过某些特异性化合物的代谢的改变情况，研究由于雌激素缺乏对大鼠体内代谢的影响。

关键词： 代谢组学 GC/TOF-MS 脂质代谢异常 雌激素缺乏

Study of postmenopausal osteoporosis lipid metabolism and early biological diagnostic marker group based metabonomics

Abstract

In order to make the unbiased analysis of metabolomics more comprehensixe, this paper was dedicated to establish a more stable and reliable method to analyze the endogenous metabolites in blood. This experiment used the rat blood to study the dyslipidemia of postmenopausal osteoporosis with GC/TOF-MS. During the experiment, BMD、B-ALP、NTx、OPG and RANKL were determined in the serum and plasma of rat. Moreover, the similarity and relevance in internal data which were collected by GC-TOF/MS were studied using PLS-DA analysis. Cholesterol, arachidonic acid, n-dodecanoic acid, 9- (Z) - hexadecenoic acid, palmitic acid, oleic acid, glycerol, n-dodecanoic acid, stearic acid, linoleic acid, octadecadienoic acid and other differences compound were discriminated. And the effects of the estrogen deficiency on metabolism in rat were investigated via the changes of some certain specific compounds.

Key words: Metabolomics; GC/TOF-MS; Lipid metabolism; Estrogen deficiency

目录

摘要 I

ABSTRACT Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1代谢组学技术 1

1.1.1 代谢组学 1

1.1.2 代谢组学的分析技术 1

1.2 绝经后骨质疏松症 2

1.3 绝经后骨质疏松症脂质代谢异常 2

1.3.1 脂质代谢异常 2

1.3.2 脂质代谢异常与骨质疏松症的病因学联系 2

1.4 绝经后骨质疏松症 3

1.5 绝经后骨质疏松症治疗 3

1.5.1提高骨峰值 3

1.5.2防止或延缓丢失，增加骨量 3

第二章 实验部分 5

2.1 前言 5

2.2 实验部分 6

2.2.1 实验材料和仪器 6

2.2.2 动物手术及样品采集 7

2. 2.3骨质疏松症常规指标检测 7

2. 2.4 代谢组学分析 8

2. 2.5数据处理 10

2.3结果与讨论 10

2.3.1体重、子宫指数和E2含量 10

2.3.2 骨密度 12

2.3.3 骨代谢生化指标 13

2.3.4大鼠血浆总离子流图 14

2.3.5 12周PLS-DA结果 15

2.3.6 24周PLS-DA结果 18

2.3.7 12周和24周特征性小分子代谢物 19

2.3.8 讨论 20

2.4 小结 20

参考文献 22

致 谢 24

第一章 文献综述

1.1代谢组学技术

1.1.1 代谢组学

代谢组学技术是许多组学技术中的一个，它伴随生命科学发展而发展。代谢组学与其他不同，它通过观察细胞和组织等受到扰乱之后，代谢产物发生改变或代谢产物跟随着时间改变，来探究生命体系的一门科学。代谢组是指生物体内源性代谢物质的动态整体，是基因组下游产物同时亦是终极产物，它是参加生物体系新陈代谢、保持生物体基本功能的小分子化合物 ^[1]。

1.1.2 代谢组学的分析技术

代谢组学正常包含数据的收集、提前处理、标识物辨别等过程。先收集样本，其次对它采取反应灭活及预处理。再运用核磁共振、质谱等分析方法检查样品中全部代谢物的品种、形态，以致得到许多初始的体现生物样品讯息的资料，然后利用多变量数据分析方法对得到数据举行降维和信息挖掘，从这些繁琐大量的讯息中发现最主要最能够反应出代谢物改变的主要成分，再用模式识别将它与标准的代谢物图谱进行比较，或是依据代谢物图谱在时程上的改变来查找生物标识物，探究有关联的代谢物改变触及的代谢路径和代谢改变规则，来说明生物体对一系列刺激做出的的回馈。同时因为不同的分析技术各有其特色，因此在不同应用领域使用的分析技术亦然有所不同^[2]。 代谢组学的技术包含NMR 、电喷雾电离质谱( ESI-MS ) 、液相色谱-紫外光谱-质谱联用 ( LC-UV-MS ) 、串联质谱 ( andem MS) 以及液质联用 ( LC-MS )等^[3]。其中气质联用在诊断代谢组学、药物毒理研究等范畴有被十分普遍的采用。研究表示，利用气相色谱-质谱可以检测出49种大鼠尿样中内源性的代谢产物，而且有26种达到定量标准。气质联用优点是有比较好的分辨率及检测灵敏度，而且还可以提供值得借鉴、对比的标准谱图库。气相色谱-质谱不足体现在不可以对难挥发性组分完成分析，以至于不可获得系统中许多不易挥发的成分的讯息^[2]。 代谢组学技术发展的早期时候，核磁共振被广泛应用于毒性代谢组学技术的专研。相对质谱及其它联用数据来说， 核磁共振的原始数据办理方法要简便少许,它主要主要包含数据改变、标准化、匹配等环节。对于这些，实验者建议了一些软件和算法。英国Birmingham大学Viant等^[5-6]选用matlab编写的软件ProMetab能够处理一维核磁共振谱图和二维核磁共振谱图的投影图 ^[7]。

1.2 绝经后骨质疏松症　

骨质疏松是一种骨骼疾病。骨质疏松症以骨质含量降低、骨微小构造被损坏为特点, 从而导致骨的弱性增大, 导致极可能导致骨断裂^[8]。绝经后骨质疏松症 (Postmenopausal Osteoporosis，PM0P) 是原发性骨质疏松症，和雌激素水准降低有关，具备伴随着绝经时间变长和年龄增大而变大的特征。绝经后骨质疏松症临床表示为是腰酸背痛、身体缩短，乃至骨折，和因为这而引发的许多病发症，其导致残疾的机率和导致死亡的机率比较高^[9]。

1.3 绝经后骨质疏松症脂质代谢异常

1.3.1 脂质代谢异常

脂质代谢异常症, 是指血浆胆固醇甘油三酯等血浆脂质成分的异常偏高或偏低, 和在组织中各类脂质的贮留, 如黄色瘤等^[10]。

1.3.2 脂质代谢异常与骨质疏松症的病因学联系

脂质代谢异常与骨质疏松症之间的联系引起了人类广泛的注意。一些人对绝经后妇女观察时察觉骨质的含量遗失与血脂水准变高相关。Yamaguchi等通过考查了214例绝经后妇女,其显示血脂水准与骨量和骨的脆弱性关联。MassePG等研究以为在看起来正常的绝经后妇女，她们体内骨质发生疏松和心血管病的危险要素是同时存在的 ^[11]。在OVX大鼠中，雌激素水准减少致骨的体积降低、表面积变大^[12]。

1.4 绝经后骨质疏松症

依据有没有骨质疏松和骨折可以将分为没有骨质疏松组，骨质疏松但没有骨断裂组和骨质疏松同时有骨断裂组，检测每一组的骨密度和骨钙素的水平。标志物的检测对骨遗失概率的评价、病况发展的考察、治疗效果检测都有十分要紧的用处^{[ 13]} 。血清N-MID、P1NP 各种水准：骨质疏松无骨的断裂组高于没有骨质疏松组，骨质疏松伴随着骨的断裂组高于骨质疏松无骨的断裂组,并且差别有统计学作用(P lt;0 .05);Pearson′s 相关性分析结果表明， BMD 与 P1NP、 β-CrossLaps、N-MID都是显著相关(r分别等于0 .328、0 .280 、0 .315 , P lt;0 .05)。结果表示骨代谢标志物水准与骨质疏松的产生有着十分重要的联系^[8]。

1.5 绝经后骨质疏松症治疗

1.5.1提高骨峰值

骨峰值与遗传有关，但亦受到其它系数影响。钙摄入量不够是骨质疏松症发生的主要原因之一 ，绝经后女性在青春期、妊娠期、绝经期后钙需要量比较大。Kaltenborn建议绝经期后每日钙吸入的量为1500mg。既往摄入的钙量低于400rag／a的妇女，服用枸橼酸可降低脊椎骨骨质遗失。Ravnilkar 推荐碳酸钙抗酸疗法，因其既经济又易接受。吸收不良的老年妇女可服用枸橼酸钙，应在绝经前就开始使用钙剂，对已发生骨质疏松者，补充钙剂只是一种辅助疗法。

1.5.2防止或延缓丢失，增加骨量

绝经后骨质疏松主要与雌激素水平降低有关，增加雌激素可有效地防止骨遗失。绝经后每天服用结合型雌激素可使骨质疏松症发病率下降。雌激素的功能是抑制破骨细胞的形成,它是一种抗吸收制剂。以防骨遗失的最有效办法是绝经之后3年内增加雌激素。因在绝经刚刚开始的时侯，骨代谢一直是一种较高的转变状况，呈潜在竹骨丢失加速倾向。此时补充雌激素可抑制增高的骨转换，直至骨代谢达到新的平衡状态，应用5年以上可取得良好的防治效果，长期使用对乳腺癌导致的影响尚无结论。

孕激素可加强雌激素疗效,两者合用可提高骨密度。目此，雌孕激素周期疗法或持续疗法都具有比较高的安全性。单纯使用孕激素是否能预防治疗骨质疏松症仍需要一些探究。因此，不宜提倡单纯应用孕激素预防治疗骨质疏松症。

请支付后下载全文，论文总字数：16047字