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摘 要

]目的：建立FXa抑制剂筛选体系，对样品进行体外筛选；根据对筛选样品结果的分析判断，选择具有潜在临床开发前景的样品，为深入开发研究提供实验数据。方法：采用吸光度法测定酶与底物反应系统的吸光度值，考察受试样品对FXa活性的影响。结果:从13种样品中筛选得到022、028样品对凝血因子Xa活性具有较强的抑制作用。结论：028样品对凝血因子Xa活性具有最强的抑制作用。

[关键词]凝血酶抑制剂; FXa抑制剂；体外筛选

SCREENING OF HUMAN FACTOR XA INHIBITOR

Jia Yinjie

[Abstract]In recent years,with the study of blood coagulation and hemostasis mechanism deeply and R amp; D of antithrombotic drugs,all kinds of new anticoagulants are constantly emerging.This paper reviewed the direct thrombin inhibitors, FXa inhibitors and mechanism of action,other new anticoagulant pharmacological characteristics,clinical application and adverse reaction.

[keyword] thrombin inhibitors; FXa inhibitors; computer aided design

近年来随着凝血和止血机制研究的深入以及抗血栓药物的研发,各类新型抗凝药物不断涌现。心肌梗塞、 不稳定心绞痛及肺栓塞（pulmonaryem-bolism，PE）等疾病发生的关键性因素是人体血管内形成了血栓，因此阻断凝血链，进而阻止血栓的形成是目前最有效地治疗和预防这些血栓性疾病的手段之一^［1］。而人体内的凝血途径分为内源性凝血和外源性凝血两条途径。内源性凝血途径是指参与凝血的因子全部来自血液，此过程中的表面激活可使IXa 因子与 VIIIa 结合成复合物，进一步激活X因子生成Xa因子。外源性凝血途径是由来自于血液之外的组织因子（tis-sue factor，TF）暴露于血液而启动的凝血过程，在此过程中TF与VIIa因子结合，在磷脂和钙离子存在下迅速激活X因子生成Xa 因子。其中，位于这两条途径接合处的丝氨酸蛋白酶Xa因子（FXa），与Ⅴ因子通过钙离子连接在磷脂表面形成凝血酶原复合物，并使凝血酶原转化为凝血酶，继而促使血栓的形成^[2]。Ｘａ因子其位置特殊性决定了其作用的重要性，因此凝血因子Xa抑制剂成为当前研究的一个热点。

本实验在优化凝血因子Xa抑制剂筛选反应体系后，对企业样品进行体外筛选。根据筛选结果，选择具有潜在临床开发前景的样品，为深入开发研究提供实验基础。本文就直接凝血酶抑制剂、FXa抑制剂以及其他新型抗凝药物的作用机制、药理学特点、临床应用以及不良反应等作一综述。

目录

第1章 绪论 3

1.1引言 3

1.2研究对象介绍 3

1.2.1FX的理化性质 3

1.2.2FX的分子结构 3

1.2.3FXa抑制剂的种类 3

第2章 实验 4

2.1实验目的 4

2.2实验原理 4

2.3实验器材 4

2.4实验设计 4

2.4.1样品配制 4

2.4.2实验步骤 4

2.5预实验（附图） 5

2.5.1加样检测 5

2.5.2数据记录与分析 5

2.6酶的优化 6

2.6.1初步实验 6

2.6.2体系确定及7#、19#初筛 6

2.6.2.1加样检测 6

2.6.2.2数据记录与分析 6

2.7全部样品筛选 7

2.7.1配制所有剩余样品 7

2.7.2加样检测 7

2.7.3数据记录与分析 8

2.8可疑样品筛选 11

2.8.1检验改变反应体系对抑制作用有无增强 11

2.8.1.1改变反应体系筛选 11

2.8.1.2数据记录与分析 11

2.8.2不改变反应体系进行筛选 12

2.8.2.1加样检测 12

2.8.2.2数据记录与分析 12

2.9实验结论 12

第3章 结果讨论 13

3.1国外研究现状 13

3.2国内研究现状 13

3.3现有研究方法的不足 13

参考文献 13

致谢 14

第1章 绪论

1.1引言

凝血因子X (Factor X)是一种丝氮酸蛋白原酶,依赖于维生素K。其基因位于第13号染色体, 含7个内含子和8个外显子, 8 个外显子分别编码FX 的7个结构功能区。FX被活化后成为FXa,此时重链N 端A rg 52和Ile53 之间的肽键被切断, 掉下一5 2 氨基酸肽。抗凝血酶Ⅲ,α1一抗胰蛋白酶和α2一巨球蛋白酶是FXa的主要生理抑制剂^[3]。

1.2研究对象介绍

1.2.1FX的理化性质

分子量(M W )为59000 ,由重链MW 42000) 和轻链MW 16200)经二硫键连接而成, 在血液中的浓度为1. 3 μM / L , 半衰期47~ 72 h, 是一种糖蛋白, 含CHO 15%。电泳介于前白蛋白与α球蛋白区, 等电点4. 9 ~ 5 .2。

1.2.2FX的分子结构

FX的基因位于第13 号染色体上^[4]，大小约2 2 k b , 含8 个外显子和7 个内含子, 其中cDNA 全长1502 个b p , 包括5`非翻译区的2 5 个b p 和编码40个氨基酸的p r e 一Pro引导序列的120 个bp，以及编码成熟蛋白的核苷酸序列^[5]。mRNA为1.5kb。FX合成时其前体为一单链多肽原, 以双链形式存在的FX存在于血液中。单链的F X 从N端到C端有信号肽区、前肽区、γ-羟基谷氨酸区(Gl a）、芳香族氨基酸集中区、上皮生长因子样结构区(E G F)、酶原活化区以及催化区等结构功能区^[6]。正常情况下, 体内有少量A T 一l 与血管壁上的肝素样糖蛋白以活化形式存在并结合, 其抗F X a 作用要比游离于血浆中的A T一I 强很多^[7]。

1.2.3FXa抑制剂的种类

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