摘 要

米草属为禾本科植物，而互花米草就是米草属种类的其中之一。以“2-苯基色原酮”为基本母核的化合物中，就是其中的一系列化合物。在各类研究中发现，“黄酮类化合物”是普遍存在于植物体内的一种次级代谢物。互花米草的叶部含有大量的黄酮，远超于自身根部、根状茎、茎部和种子中的含量。黄酮类物质具有多种药理作用。在医学上，黄酮类物质具有良好的免疫、消炎、降血糖、降血脂以及抗氧化等功效。本文将分几个部分深度探讨互花米草总黄酮(TFS)的降尿酸药效，这是一种未被广泛研究的药效。

本课题在研究过程中，将采用醇提法提取总黄酮。该方法是目前提取总黄酮最方便、最有效的方法，通过实验检测，我们知道使用浓度大于60%的乙醇提取总黄酮，就能得到最大收益。实验过程中，首先通过对实验小鼠施用氧嗪酸钾制备小鼠高尿酸血症模型，并利用别嘌醇作为阳性对照，之后建立尿酸分析方法，最后采用高效液相色谱法测定血清尿酸含量，从而测定总黄酮的降尿酸效果。

关键词：互花米草总黄酮 高尿酸血症 血清尿酸 高效液相色谱法

Pharmacodynamic Study of Total Flavonoids of Spartina alterniflora

Abstract

The genus Hydrangea is a gramineous plant, and Spartina alterniflora is one of the species of the genus. Flavonoids are a series of compounds with 2-phenylchromanone as the basic nucleus and a secondary metabolite widely present in plants. The leaves of Spartina alterniflora contain a large amount of flavonoids, far exceeding the content of roots, rhizomes, stems and seeds. Flavonoids have a variety of pharmacological effects. In medicine, flavonoids not only have good anti-oxidant，immunity, hypolipidemic，hypoglycemic,but also have anti-inflammatory,,and other effects. This article will explore the uric acid-lowering effect of total flavonoids of Spartina alterniflora, which is a new drug effect.

This project will use alcohol extraction to extract total flavonoids, which is the most convenient and effective method for extracting total flavonoids. The best benefit is obtained by using 60% ethanol extraction. The mouse hyperuricemia model was prepared by administering potassium oxonate to mice, using allopurinol as a positive control, then establish a uric acid analysis method and the serum uric acid content was determined by high performance liquid chromatography to determine the uric acid lowering effect of total flavonoids.

Keywords: Total Flavonoids from Spartina alterniflora; hyperuricemia model; Serum uric acid；high performance liquid chromatography

目录

摘要 I

Abstract II

目录 III

第一章 文献综述 1

1.1 引言 1

1.2 互花米草的成分 2

1.3 总黄酮的药效 2

1.3.1 解热作用 2

1.3.2 抗炎作用 2

1.3.3 抗氧化 2

1.3.4 降血糖功能 3

1.3.5 降血脂作用 3

1.3.6 免疫功能 3

1.3.7 降尿酸作用 3

1.4 高尿酸血症 3

1.5 高尿酸血症小鼠模型建立方法 4

1.6 总黄酮降尿酸研究现状与发展动态 5

1.7 本课题的研究思路及意义 5

第二章 互花米草总黄酮的药效学研究 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 实验仪器 7

2.1.2 实验试剂 7

2.1.3 实验动物 7

2.2 尿酸分析方法的建立 8

2.2.1 色谱条件 8

2.2.2 尿酸标准品溶液的配制 8

2.2.3 血样的处理 8

2.2.4 方法学考察 8

2.3总黄酮药效研究 10

2.3.1 互花米草总黄酮的配制 10

2.3.2 小鼠高尿酸模型的建立 10

第三章 实验结果与讨论 12

3.1 专属性 12

3.2 线性 13

3.3 精密度 13

3.4 重复性 14

3.5 回收率 15

3.6 稳定性 15

3.7 检测限与定量限 16

3.8 样品对高尿酸血症小鼠血清尿酸的影响 16

第四章 结论与展望 17

参考文献 18

致谢 20

第一章 文献综述

引言

互花米草属于禾本科米草属，互花米草原生长于美国，之后引入中国的一种多年生高杆型草本植物[1]。该植物常用于改善土壤，改善海边生态环境，生长于海滩潮间带。温度和湿度对互花米草的影响不大，该植物特别是在碱性环境下的耐受力极强，可见其生命力之旺盛。互花米草中含有各种物质，营养十分丰富。并且其叶部富含黄酮物质，这主要是因为叶部光合效率高造成的。互花米草总黄酮（TFS）是互花米草的一类次级代谢物[2]，该物质被看做是植物体内最重要的抗氧化成分之一，可消除羟自由基等活性氧物质，并对植物有光保护作用[3]。黄酮——“2-苯基色原酮”，而本次课题研究的“黄酮类化合物”，它的结构就是以黄酮（2-苯基色原酮为母核），并在母核上连接各种取代基。

本课题在研究过程中的主要任务以及主要操作，就是从互花米草中提取出总黄酮，然后利用氧嗪酸钾制造出的高尿酸血症小鼠模型，最后利用高效液相色谱法检测小鼠血清尿酸水平来评估总黄酮的降尿酸效果。目前市面上广泛应用别嘌呤醇等药物降低尿酸，但是此类药物毒性强，副作用过大而且对于总黄酮降尿酸的药效研究不足，所以我们对中药互花米草总黄酮进行研究，以期减少药物对人体的毒副作用。这是我们实验的一个创新点，也是该论文的现实意义所在。

图 1‑1 总黄酮结构式

Fig. 1-1 the structure of Total flavonoid.

互花米草的成分

通过现在已有的研究表明，“互花米草”的成分十分丰富，其中含有有机酸类、氨基酸、香豆素、蛋白质、糖类、黄酮类和生物碱类，而且该植物中还富含丰富的氨基酸种类、挥发性物质、13种脂肪酸和各种微量元素，例如铁、铜、锌等。互花米草干草中还含有粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、无氮浸出物、钙和磷等[4]。

总黄酮的药效

解热作用

范丽等人运用家兔进行研究，以确定总黄酮的解热作用。在实验中，对实验家兔进行皮下“松节油”的注射操作，并通过对家兔静脉注射“大肠杆菌液”的方法，使得实验家兔的体温升高，然后对实验中体温升高的家兔进行灌胃“总黄酮化合物”的操作。该研究发现，在给药150min之后使得家兔的异常体温下降，由此可以说明总黄酮在较大剂量使用时具有一定的解热作用[5]。

抗炎作用

实验表明，TFS外用在一定程度上可以抑制炎症早期的毛细血管通透性提高和水肿，中期的炎性渗出，并且其作用会随着药物浓度的提高而增强。局部涂抹不同剂量总黄酮化合物(200、100、50 mg/kg)，都可以使二甲苯致小鼠耳片肿胀的程度明显减轻。50 mg/kg的总黄酮化合物可减少皮下埋植棉球致肉芽组织的新生肉芽组织生成量，这个现象说明局部涂抹总黄酮化合物对急性炎性反应的抑制作用强于对慢性炎性反应的抑制作用[6]。

抗氧化

实验表明，TFS有很强的抗氧化功能，TFS可明显清除DPPH 自由基，且随着浓度增加，清除能力增强；同时，TFS也对可明显清除羟基自由基[7]。

降血糖功能

在研究中，对正常小鼠注射大剂量的TFS会发现其血糖值会发生显著的降低。其原理相似于许多植物降低动物血糖的药理作用。即药效使得胰岛β-细胞分泌出胰岛素，然后使得动物血糖降低[8]。实验中，陈老师使用3T3－L1脂肪细胞的葡萄糖消耗细胞模型进行研究，发现当总黄酮化合物在1～100 mg/L的浓度范围内时，可以不同程度地增加脂肪细胞对葡萄糖的消耗速率，同时表现出一定的量效关系[9]。

降血脂作用

在缪老师的研究结果中，我们得知只有TFS在一定剂量水平下对大鼠才有降低血脂的作用[10]。高脂血症大鼠模型通过注射脂肪乳剂制备，当TFS浓度为7.5ml/kg·d时，没有使得有高脂血症的实验体，其血脂有明显变化；但如果将TFS剂量加大到15 ml/kg·d的时候,实验体血清甘油三酯和血清总胆固醇明显降低。

免疫功能

实验表明，TFS 使免疫抑制小鼠的免疫器官-胸腺重量增重，而对脾脏重量无影响；TFS也使巨噬细胞吞噬功能增强。TFS低浓度时促进非特异性免疫系统，提高细胞的免疫功能，然而高浓度时却抑制非特异性免疫系统，这说明TFS可对机体产生免疫调节[11]。

降尿酸作用

总黄酮可以抑制肾脏氧化应激和炎症反应通过促进尿酸排泄；也可以显著增加抗氧化酶的活性，例如SOD；通过抑制炎症因子例如IL-6, TNF-α, IL-1β和COX-2的表达来抑制肾脏免疫反应；也可以通过显著抑制尿酸的产生或者提高尿酸的排泄来减少肾脏损伤[12]。

高尿酸血症

据统计，中国患有高尿酸血症的人数高达人口总数的12%。而在高尿酸血症患者中，有着八千万的痛风病患。这种代谢类疾病的发病人数仅次于中国糖尿病患者的人数。许多研究认为，人类患有高尿酸血症的原因，与患者尿酸的分泌与排泄密切相关。高尿酸血症极有可能发展为痛风，是变为痛风的最危险因素之一[13]。许多的研究显示，这类疾病并不是一种仅仅因为尿酸超标而导致患者患病的病症，而是与心脑血管类疾病或是肾类疾病等疾病相关的病症。尿酸这个关键因素不仅与痛风的可能性增加有关，还与心血管疾病、糖尿病、肾结石、肥胖和血脂异常的风险上升而有关[13]。痛风这种关节炎类型疾病，其男患者的人数明显高于女患者。很多因素都可能导致痛风，例如肥胖、过量饮酒、高血压、高血糖，使用高嘌呤食物、某些药物都可能增加产生痛风的风险。晚期痛风还拥有以下三个特点：慢性关节痛，运动受限制和反反复复发作。

如今临床上治疗上述类型疾病的各类药物，其方式包括两种，一是通过抑制患者体内形成过多的尿酸，如别嘌呤醇（其工作原理，就是降低黄嘌呤氧化酶的活性，酶的活性降低就会使得更少的黄嘌呤等物质进一步转化为尿酸）；二是通过增进患者的排泄来降低其体内尿酸，如丙磺舒和苯溴马隆（其工作原理，就是通过降低尿酸盐转运体的活性，来增加尿酸的排泄）。但是别嘌呤醇长期使用会导致严重的副反应，例如体温升高、胃肠道反应，肝肾功能损伤，超敏反应综合征等；长期服用苯溴马隆可引起线粒体功能障碍，甚至造成肝毒性[14]。

高尿酸血症小鼠模型建立方法

制备高尿酸血症小鼠模型的药物基本可以分为三类：直接增加尿酸的药物，例如次黄嘌呤和尿酸；抑制尿酸在动物体内的分解，例如氧嗪酸钾；竞争性抑制尿酸排泄导致尿酸在体内大量蓄积的药物。根据文献报道，大部分学者采用氧嗪酸钾制备高尿酸血症小鼠，也有将氧嗪酸钾和次黄嘌呤合用进行制备的。