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基于代谢组学对奥硝唑诱导大鼠弱精子症的病理机制研究毕业论文

 2020-04-24 11:18:17  

摘 要

目的:基于气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)的代谢组学分析技术,研究并比较奥硝唑所诱导的弱精子症病理模型大鼠与空白对照组大鼠附睾液,分析其差异代谢物,探索可能的病理机制。

研究方法:将大鼠随机分为空白对照组与病理模型组,模型组以奥硝唑连续给药3周建立弱精子症动物模型。每周处死一批大鼠,测定性腺指数,精子参数与生化指标,收集附睾液样本。使用GC-MS技术对两组大鼠的内源小分子代谢产物进行检测,动态监测造模过程中附睾液代谢组的变化。多变量统计分析包括主成分分析法(PCA)和偏最小二乘-判别法(PLS-DA)。结合多变量和单变量统计分析,筛选两组间的差异代谢物,分析其涉及的相关代谢通路。

结果:PLS-DA得分图显示,自给药后第2周,弱精子症模型组代谢物与空白对照组相比开始出现差异,直至造模终点,模型组与空白对照组得到完全区分。与空白对照组相比,弱精子症模型组附睾液中缬氨酸、棕榈酸、山梨糖醇、硬脂酸等4种代谢物显著升高;乌头酸、乳酸、延胡索酸、葡萄糖、丙酮酸等5种代谢物含量显著降低。

结论:基于GC-MS的代谢组学分析技术可有效模拟由奥硝唑所致大鼠弱精子症的病理进程,结合多变量和单变量统计分析发现,所得差异代谢物含量的异常变化提示弱精子症大鼠附睾液中能量代谢异常低下,这与弱精子症密切相关。

关键词:代谢组学 弱精子症 奥硝唑 气相色谱-质谱

ABSTRACT

OBJECTIVE: To investigate the differential metabolites and possible pathological mechanism of ornidazole-induced asthenozoospermia in rat epididymal fluid by metabolomic analysis based on gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS).

Methods: Rats were divided into blank control group and pathological model group randomly. The model group was continuously treated with ornidazole for 3 weeks to establish asthenozoospermic rat model. A group of rats were sacrificed weekly, the gonadal index, sperm parameters and biochemical indicators to be detected and epididymal samples to be analyzed. The endogenous small molecule metabolites of the two groups of rats were detected by GC-MS technique, and the changes of the epididymal metabolome during the modeling process were dynamically monitored. Multivariate statistical analysis mainly consisted of principal component analysis (PCA) and partial least squares-discrimination (PLS-DA). Combining with multivariate and univariate statistical analysis, found the differential metabolites which were used to analyze related metabolic pathways.

RESULTS: The PLS-DA score plots showed that the metabolites of the asthenozoospermic model group began to differ from the blank control group at the 2nd week after administration, the model group was completely distinguished from the blank control group until the modeling end point. Compared with the blank control group, four metabolites, proline, palmitic acid, sorbitol and stearic acid included, in the epididymis of the asthenozoospermia group were significantly elevated, while five metabolites, aconitine, lactic acid, fumaric acid, glucose and pyruvic acid included, were significantly reduced.

Conclusion: The GC-MS based metabolomics platform can effectively monitor and visualize the pathological process of ornidazole-caused asthenozoospermia. Multivariate and univariate statistical analysis exhibited the abnormal changes of epididymal metabolome in asthenozoospermic rats, found the differential metabolites, and further the related glucose metabolism, were closely associated with asthenozoospermia.

Key words: Metabolomics; Asthenozoospermia; Ornidazole; GC-MS

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1弱精子症 1

1.2奥硝唑 1

1.3代谢组学 2

1.3.1介绍 2

1.3.2代谢组学检测技术 2

1.3.3代谢组学的应用 3

1.3.3.4代谢组学在男性不育方面的应用 4

第二章 材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.1.1实验动物 5

2.1.2实验试剂 5

2.1.3实验仪器 5

2.2实验方法 6

2.2.1动物造模 6

2.2.2性腺指数检测 6

2.2.3精子密度和精子活力检测 6

2.2.4血清及附睾液样品的收集 7

2.2.5生化指标检测 7

2.2.6大鼠附睾液代谢组学研究 7

第三章 结果与讨论 9

3.1病理进程中动物状态观察 9

3.2大鼠体重增量和性腺指数结果 9

3.3大鼠精子密度和活力变化 10

3.4血清生化指标检测结果 10

3.5附睾液代谢组学结果 11

3.6差异代谢物的筛选 15

3.7代谢通路分析 17

第四章 结论与展望 19

4.1结论 19

4.2展望 19

参考文献 20

致谢 23

第一章 文献综述

1.1弱精子症

在现代社会高速发展的影响下,人们的工作压力不断增加,生活节奏不断加快。不少人的生活习惯和饮食习惯随之发生了相应的转变,这使得不孕不育症的发病率日趋升高。据报道,大约有15 %到20 %的育龄夫妇存在生育方面的问题。许多夫妻因为不能自然怀孕而寻求医学帮助,在这些人群中有至少50 %存在男性精子问题。虽然这一问题的机制研究尚不完善,但在这些不育的男性患者中,弱精子症的比例占到了70 %[1]。弱精子症主要指精液参数中向前运动的精子(a级和b级)小于50 %,或者向前运动的a级精子小于25 %的一种病症[2]。为此关注男性弱精子症的病理机制,对促进人类生息繁衍、社会快速发展、家庭和谐美满具有重要意义。

弱精子症的病因复杂,与环境因素、职业暴露、染色体异常、基因缺失、感染、内分泌因素[3]、精液不液化、某些免疫因素、精索静脉曲张[4]、微量元素缺乏[5]、医源性疾病等有关。正是由于其病因的复杂性,对其病理机制的研究仍未达到尽头。

1.2奥硝唑

奥硝唑(Ornidazole, ORN)是第3代硝基咪唑类衍生物,具有良好的抗厌氧菌和抗原生质感染作用[6];在临床上广泛应用于预防和治疗术后感染以及生殖系统感染[7-8]。有研究报道称,奥硝唑通过增加细胞脂质过氧化产物丙二醛,抑制附睾中的能量转换酶或非蛋白类物质使精子细胞受损、活动力降低,严重阻碍受精作用过程的有效进行[9]。这种药物属于临床常用药物,通常需要长期服用,这往往会导致精子活力降低,诱导男性弱精子症,严重危害男性生殖健康。

1.3代谢组学

1.3.1介绍

代谢组学是研究各种病理生理条件下代谢产物丰度、代谢途径和代谢网络变化的有力工具,为基因型/表型以及基因型/环境型相互作用的识别提供了平台[10]。是研究代谢过程、识别代谢特征的关键生物标志物和揭示代谢机制的有力工具[11]。代谢物是在代谢过程中经历化学转化的小分子物质,因此,它们往往会提供细胞状态的功能读数。基因和蛋白质的功能分别受遗传调控和翻译后修饰,与它们不同,代谢物是生物活性的直接标记,因此更容易与表型相关联。有研究结果表明,代谢产物和小分子并不是相互独立的。它们通过多种生物化学途径和广泛的代谢网络而联系在一起,这些代谢网络依赖于各种遗传和信号网络进行自我调节。在这种情况下,代谢物分析法或者说代谢组学已成为一种广泛用于临床诊断的有效方法。更重要的是,基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学的新一代整合研究提高了对生物体对内、外部环境反应机制的理解

1.3.2代谢组学检测技术

代谢组学主要依靠高通量的分析技术来识别、量化和表征细胞或生物体中的小分子或者说代谢物。随着检测技术的发展,现在可以从少量的样品中快速检测出数千种代谢物。特别是近年来,生物信息学相关的仪器、工具和软件的创新使得人们能够无偏差地对细胞代谢物进行全面分析。代谢组学中最常用的技术是核磁共振(NMR)光谱和质谱(MS)[12]。其中最流行的分析方法质谱包括气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)和毛细管电泳耦合质谱(CEMS),这四种分析方法为代谢组学提供了技术支柱[13]。每种技术都有其优点和缺点,核磁共振(NMR)提供了一种原位监测某些代谢物的方法,具有高重现性且实验室间差异小。更重要的是,NMR可以快速、无损、自动化地分析粗提物,并定量检测许多不同的代谢产物,但缺点是其灵敏度和动态范围的限制。GC-MS融合了70ev标准MS电子电离能高分辨率、分离重现性和稳定代谢产物破碎模式的优点,非常适合分析挥发性和非挥发性化合物(或具有挥发性衍生物的化合物)[14]。GC-MS长期以来一直用于生物液体的代谢产物的鉴定。然而,这种技术可以分析的代谢物种类受到分子挥发性或形成适当挥发性衍生物的能力的限制。LC-MS可以分析不稳定但不挥发的化合物,检测的分子范围从极性糖和非芳香有机酸到各种脂质。GC-MS与NMR/LC-MS的结合已广泛应用于小分子/代谢物的分离、修饰和表征。这促使化合物结构分析进一步改进和能够更好的解释靶向代谢组学。代谢组学数据记录形式多为不同保留时间、质量或质量碎片(质谱数据)或化学位移(NMR数据)上不同强度的未分配峰。对这些数据的分析和解释说明,在不同的基于质谱的平台中具有共同特征。利用软件从总离子色谱中提取各化合物峰的面积,根据保留时间和质谱的匹配对化合物进行鉴定。在进行统计分析之前,必须对数据矩阵进行归一化处理,标准化因素取决于不同的需求。在相关的质控样品中,一般采用从完整数据集中提取的内部标准或统计模型,如总峰强度、四分位范围或对应的代谢物片段。归一化处理后,采用多元统计方法或模式识别方法对采集的数据进行处理,寻找特征代谢产物,从被测样品中识别生物标志物。

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