核苷是含氮碱基与糖组分缩合成的糖苷[1]。核苷中的戊糖有核糖和脱氧核糖两种，常见碱基有胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤。核苷类似物是由核糖或脱氧核糖在其C1位连一个碱基（嘌呤或嘧啶）后形成的一系列化合物统称[2]。由于碱基和戊糖存在着多种结构修饰，所以核苷类似物种类繁多。核苷类似物可以作为食品和保健品的添加剂；目前我国食品添加剂使用标准GB 2760-2011允许使用的呈味核苷酸包括：5#8217;-呈味核苷酸二钠(I G)，5#8217;-肌苷酸二钠（IMP）和5#8217;-鸟苷酸二钠（GMP）三种，这三种被称为食品增味剂。更为重要的是，还可作为药物治疗艾滋病、肿瘤、心血管等多方面的疾病。在目前的抗病毒药物中，核苷类似物占到一半以上，主要是病毒复制过程中酶的抑制剂。众所周知，核苷在细胞生命中占有极为重要的地位，可以用与天然核苷结构类似的改造核苷干扰肿瘤细胞的生长和病毒的繁殖，通过抑制病毒DNA 多聚酶和逆转录酶的活性并与核苷酸竞争性掺入病毒 DNA 键，从而终止或抑制病毒DNA链的延长和合成，使病毒的复制受到抑制而发挥抗病毒作用。在抗肿瘤药物中，核苷类似物占到了市场五分之一的份额，核苷类似物利用生物电子等排原理，对嘌呤核苷、嘧啶核苷的结构进行化学修饰，经细胞内三磷酸化后，通过抑制脱氧核苷三磷酸的合成、掺入DNA或RNA分子中干扰细胞复制、竞争性抑制DNA聚合酶作用，特异性干扰核酸的代谢，阻止细胞的分裂和繁殖，最终导致肿瘤细胞死亡。现有不少核苷类药物已应用于临床，如：齐多夫定、扎西他滨、克拉屈滨、拉米夫定、阿巴卡韦、氟达拉滨、阿洛夫定等[3,4,5,6]。

目前合成核苷类似物主要有三种方法：化学法、发酵法、酶法。[7,8]化学合成法有多种途径，缺点是步骤多、反应条件苛刻；所用试剂昂贵并有一定毒性，生产成本高且收率低。发酵法是利用微生物培养使其在培养基中积累核苷，这个方法周期长，易染菌，收率低，将DNA酶解后，分离4种脱氧核苷，分离工程繁杂，成本高。而且这种方法目前还只限于几种天然核苷，对于脱氧核苷和一些修饰核苷无能为力。酶法生物合成则具有专一性强、原料易得、操作简单、反应时间短、反应条件温和、不易染菌、产率高等特点。

到目前为止，绝大多数的核苷类似物通过化学方法合成。较为经典的方法就是采用碱基与核糖进行缩合，得到α、β同分异构体，然后去掉保护基团后，再进行分离；也可以以天然的核苷为原料，对其碱基或核糖基进行修饰。但化学法操作复杂，反应繁多，需要对碱基或核糖基上的活性基团进行修饰保护，并且最终的转化率不高，产物成分复杂，一般得到的是α、β同分异构体，还需要对其拆分才能得到有活性的β型核苷，因此分离纯化难度大[9]。而且使用到大量有毒有害试剂，给环境带来了严重的污染。

利用酶促反应来合成核苷类似物具有高效、特异、环保、快速、经济、无溶剂等优点。酶合成法主要利用核苷磷酸化酶，无论是在动物还是在微生物中，核苷磷酸化酶都广泛存在，目前所知的产核苷磷酸化酶的菌株有：欧文杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和乙酰短杆菌等等[10]。核苷磷酸化酶[11]分为嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶，后者又分为胸苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶[12]。核苷磷酸化酶在进行核苷及其他类似物合成时，它能催化核苷或脱氧核苷的可逆磷酸化反应。核苷在核苷磷酸化酶的作用下可以裂解为含氮碱基和戊糖的磷酸酯，即在体内核苷合成的补救途径中核苷（或脱氧核苷）的糖苷键发生可逆的磷酸化反应，从而生成碱基和核糖-1-磷酸，如果在这种时候将其它类型的碱加入基就能够形成另外一种新的核苷（或脱氧核苷）。在酶法合成嘌呤核苷类似物时，主要是用嘧啶核苷磷酸化酶水解嘧啶类核苷提供核糖供体，再加入嘌呤碱基，在嘌呤核苷磷酸酶的作用下催化合成嘌呤核苷[13]。其原因如下：1、嘧啶和嘌呤核苷磷酸化酶在热动力学方面分别偏向于水解合成，双酶催化有利于产物的累积。2、第一步反应所产生的嘧啶碱基，不会参与第二步反应，不会因为积累而抑制第二步反应[14]。由于双酶在同一反应体系下反应，需要考虑到1、双酶存在反应条件的匹配性；2、中间体磷酸戊糖的不稳定性。为克服这些问题我们打算将嘧啶核苷磷酸化酶与嘌呤核苷磷酸化酶连接在一起形成融合蛋白[15,16]。本实验中我们选用尿嘧啶核苷磷酸化酶与嘌呤核苷磷酸化酶融合因为它们具有相似的单体结构。但尿嘧啶核苷磷酸化酶与嘌呤核苷磷酸化酶这俩种酶都是多聚体，在蛋白融合时可溶性表达水平不高。针对提高在大肠杆菌中重组蛋白质的可溶性表达问题，我们设计了不同特性的linker，通过基因融合的手段对两酶进行融合，将成功构建的融合酶进行表达验证和活性评价，分析不同linker对融合酶的表达和活力影响，以期望得到可溶性表达水平较高的融合蛋白[17]。

核苷类似物产品使用专业性强，是生物医学研究中不可缺少的原料，是目前抗病毒药和抗肿瘤药的主力军，酶法合成的众多优势决定了酶法合成核苷是大势所趋，对核苷磷酸化酶的研究也有着重大意义。

[1] 杜玮南，孙红霞，方福德. 单核苷酸多态性的研究进展[J]. 中国医学科学院学报,2000, 4(22): 393-394.

[2] 丁庆豹．核苷磷酸化酶的克隆、表达与应用[D]．华东理工大学, 2010.

[3] Robak T, Robak P. Purine Nucleoside Analogs in the Treatment of Rarer Chronic Lymphoid Leukemias [J]. Current Pharmaceutical Design, 2012. 18(23): 3373-3388.

[4] Wallen H, Thompson JA, Reilly JZ, et al. Fludarabine Modulates Immune Response and Extends In Vivo Survival of Adoptively Transferred CD8 T Cells in Patients with Metastatic Melanoma [J]. Plos One, 2009. 4(3): 4749-4750.