文 献 综 述

选题意义：综述了近几年酶法合成核苷类抗病毒药物的研究进展，主要包括核苷磷酸化酶、N-脱氧核糖转移酶的应用，以及应用一些酶进行糖或碱基的修饰等方面。核苷类似物是抗癌、抗病毒药物取之不竭的资源库,大量经过修饰的碱基和核苷都有可能成为有用的物质。由于酶法法合成核苷具有工艺简单,反应条件温和,成本低,收率高,且不易造成环境污染,应用酶法合成核苷将是大势所趋。而高效酶法合成更是至关重要。 核苷类家族不仅包含多种天然核苷，还包括碱基或糖基被修饰过的核苷类似物^[1]。核苷类似物的化学结构与天然核苷有着不同程度的相似性，在细胞代谢中，可与正常核苷形成竞争关系，具有干扰核酸的合成及抑制相关聚合酶结合的作用，进而阻断肿瘤细胞和病毒的复制^[2]。所以合成核苷类似物在抗肿瘤等多个方面具有重要的意义。目前，制备核苷类似物的方法主要有化学合成法和生物转化法。而由主要来源于大肠杆菌、莱氏乳细菌和瑞士乳杆菌^[3]的N-脱氧核糖转移酶催化的反应能够高效地合成核苷类似物，在反应过程中无中间体的产生，且底物适用范围更广，酶法不仅避免了繁琐的保护和去保护等反应步骤、且反应条件温和、对环境友好、所得产物纯度高同时由于酶来自于生物体,可生物降解,对环境没有毒害作用,因此受到了人们的广泛关注。而为了充分利用N-脱氧核糖转移酶，我们必须充分地了解N-脱氧核糖转移酶的性质，只有在了解其性质以后才能针对它的性质进行改造从而达到更高的生物转化率和酶的利用率。

N-脱氧核糖转移酶性质的研究状况：N-脱氧核糖转移酶最先是由MacNutt 在瑞士乳杆菌中发现的^[4]。随后有研究者利用亲和层析的方法从瑞士乳杆菌中纯化得到含有两种不同活性的N-脱氧核糖转移酶^[5]：I 型（PDT），只能催化两种嘌呤碱基之间的转换反应（Pur #8596; Pur）；II 型（NDT），不仅可以催化两种嘌呤之间的转换，还能够催化嘧啶与嘧啶、嘌呤与嘧啶之间的相互转换（Pur #8596;Pur，Pur #8596; Pyr，Pyr #8596; Pyr）^[6,7]。N-脱氧核糖转移酶II（NDT）的底物识别范围较广，能够用于合成多种有重要药用价值的核苷类似物^[8,9]，但其更倾向于催化以脱氧嘧啶核苷为底物的反应^[10]。已有文献报道，NDT 基因的开放阅读框由474 个核苷酸组成，用于编码158 个氨基酸^[11]。而我们在研究的过程中的任务是以实验室菌库为基础，致力于纯化获得N-脱氧核糖转移酶纯酶，进而研究它的酶学性质。所以需要通过从微生物（如：冷解糖芽孢杆菌CECT4074）中提取出用于编码2'-脱氧核糖基转移酶（NDTs）的ndt基因再通过PCR技术如以冷解糖芽孢杆菌CECT4074的DNA染色体作为模板扩增获得^[12]。然后再针对环境对于酶活性的影响因素，分别设定不同的环境来探讨不同因素（如温度、pH等）对N-脱氧核糖转移酶的性质影响，从而可以找出最适合N-脱氧核糖转移酶的反应条件，可以促使其发挥最大的酶活性，能够更好地完成催化核苷类似物的合成。

关于酶活性的影响因素的确定：在提炼出该酶基因，进行表达和转录从而可以研究酶的活性时，首先要通过Ni柱纯化对酶进行纯化，纯化后的酶才能够测定出准确的酶活性。其次对于温度等对酶活性具有较大影响的条件，要对酶进行控制变量的方法进行研究，例如在研究固定化BpNDT活性影时，将温度从20℃增到60℃，而在蛋白质变性的情况之下酶活性下降得很快。在相同的条件下，自由可溶性酶与固定化酶相比较，最适宜温度低10℃以下。与其他固定化NDTs相比，从罗伊氏（LrNDT）中提取的通过共价固定在环氧活化吸附树脂上NDTs在不同温度下呈现的最佳活性^[13]。这样的测定方法就可以在何种温度下该酶的活性最大。同样在研究固定化的N-核糖核苷转移酶和游离态的该酶在pH中，在研究固定化BpNDT酶^[14]的过程中，我们可以借鉴其关于pH对不同形态的酶的影响运用到本实验中，我们的实验中也可以借鉴如下方法：游离酶的最佳pH 是通过测不同PH下0.4μg的BpNDT在10 mM 柠檬酸钾盐 - 磷酸盐缓冲液的活性决定的，用10 mM thymine和 10 mM 2'-deoxyuridine在标准调节下合成胸苷. 不同PH下的稳定性用4度条件下从4.0到12.0范围内不同PH值下，10 mM柠檬酸钾盐 - 磷酸盐缓冲液、150mM稳定的离子强度下培养的纯酶测定的。将酶样调整到pH 8通过加入50 mM HEPES buffer pH 8，和之前描述的一样，在40度下测的BpNDT活性, 在每个PH下的离子强度调整到150 mM通过加入用我们实验室设计的a Visual Basic program计算出的NaCl总量，允许buffer系统分析最多四个四元样品。另外，离子强度对于NDT活性的影响是通过研究在酶分析中描述的标准情况下，50 mM HEPES buffer, pH 8.0 ，40℃，不同浓度的Nacl中培养的0.4μg的酶而测得的。通过对pH和温度的不断调试，从而确定最适合的范围，对酶进行物态和其他化学条件的改变从而调节出最适合酶的反应条件，而这样的操作必须建立在对酶的性质研究透彻的基础之上。在本次试验中，我们不仅对pH、温度等因素进行研究，还要对金属、有机溶剂耐受性等多方面进行研究以确定在用于实际合成中最大的活性。

本论文的主要目的在于对N-脱氧核糖转移酶与温度、pH、金属、有机溶剂之间的关系，以确定那种对该酶的影响程度最大，从综合方面出发，以确定选择何种反应条件来进行核苷类似物的催化合成工程。

参考文献：

[1] 樊华伟，傅绍军，邵志宇，朱利民.核苷类药物酶法合成研究进展.上海：东华大学生物与技术研究所，生物技术通讯，2005，16(6)

[2] 王玺，段胜林，熊舒莉，郑桂兰，张贵友，王洪钟。自诱导系统在酶促合成2#8217;-脱氧胞苷中的应用，北京：清华大学生命科学学院;中国食品发酵工业研究院，生命技术通报，2014，11

[3] Kaminski, P.A. Functional cloning, heterologous expression, and purification of two different N-deoxyribosyltransferases from Lactobacillus helveticus. J. Biol. Chem. 2002, 277, 14400#8211;14407

[4] Macnutt WS. The enzymically catalysed transfer of the deoxyribosyl group from one purine or pyrimidine to another［J］. Biochem J,1951, 50 ：384-397.