文 献 综 述

红景天(又名北极根，黄金根)是景天科植物之一，该科植物原产于东西伯利亚的北极圈内。红景天广泛分布于欧洲和亚洲的极圈和多山地区中。其多生长于海拔11000至18000英尺以上。红景天属植物在全球约有近100种，我国有70馀种，青藏高原有55种，西藏有32种，分布于我国东北、华北、西北及西南的高寒山区[1]。红景天苷是红景天根的提取物，红景天苷（salidroside）是传统中药红景天中最重要的有效成份之一，临床上具有抗疲劳，抗氧化，保肝，改善血液循环等多种药理功能[2-4]。目前从其根、茎中分离鉴定的化学物质包括：挥发油，脂肪，甾醇，有机酸，酚类以及苷类等。其中苷类化合物是其药理活性研究中报道最多的一类成分[6]。红景天属植物化学成分种间差异很大，但绝大部分都含有苯烷基苷类，包括苯乙基苷类（红景天苷，其苷元为酪醇）、苯丙素苷类（络萨维，洛塞琳）和酚苷。此外，红景天还含有芦丁苷、熊果苷、异槲皮苷等苷类成分[7-9]。由于其功能多样且不易从自然界获得，故人工合成具有很大的市场价值。本实验主要是通过糖基转移酶ZS1和蔗糖合成酶SS的双酶融合体一步合成红景天苷。糖基转移酶将生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的产物具有很多生物学功能。葡萄糖基转移酶是在酶反应中只转移葡萄糖基的酶(Glu-酶)，葡萄糖苷转移酶是转移时连葡萄糖的糖苷键一起转移着的酶[10]。蔗糖合成酶（SS）是植物体内催化蔗糖合成的酶之一，催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖的可逆 UDP反应：Glu 果糖---蔗糖 UDP[11]。在传统的酶耦联法再生体系中, 需要分别添加底物催化酶和辅酶循环酶两种酶, 操作麻烦, 成本高, 且辅酶在两个酶分子间传递, 有可能造成辅酶再生效率不高。利用融合策略构建人工酶有可能使两个酶的活性位点接近, 从而提高催化效率[12]。

近年来，人们在双酶融合表达这个领域取得了很多成果，主要在双酶表达共催化或抑制反应的进行，以及改变酶的选择性等方面。例如，吴希等在甲酸脱氢酶与手性醇脱氢酶的融合体系构建的研究中，详细的讲述了一个双酶表达载体应该如何构建及这种体系构建与传统方法相比所具有的优势[13]。Alexander Gutmann等人在OGT-SuSy的双酶融合表达中已经知道的O-糖基转移酶（OGTs）通过糖基合成（蔗糖从大豆合成）实现UDP依赖性的蔗糖的转换，蔗糖合成反应不仅能再生UDP-葡萄糖用来给OGT（高达9倍）提供底物供体，而且还能克服在二氢査耳酮的β-D-糖基化形成（增加了底物的转化和产物产率的增长）过程中的热力学限制。使用所有耦合酶的最佳反应条件，极大的提高了简单酶耦合时所产生的收益率[14]；等等。

在这个课题中，我们的主要任务把合成上述两个酶的基因通过基因工程的方法变成一个顺序连接，由一个启动子引导的基因，经转录翻译后表达成一个同时具有两种酶活性的蛋白质。首先，我们要分别提取两种酶的的目的基因，利用设计好的引物通过PCR对两个基因的序列进行修饰，包括添加酶切位点、加入Overlap的重叠部分及去除前一个酶的终止子等。再通过Overlap PCR反应将原来两个独立的基因首尾相连，形成一个”大”基因。通过核酸凝胶电泳，判断目的基因是否连接到质粒载体上了。将筛选出的含有目的基因的表达载体进行PCR扩增，以增多目的基因的数量以增加导入到质粒载体上的机率。但是，即使混合了表达载体和感受态细胞，也不一定目的基因就导入了受体细胞；或者导入了目的基因，也不一定表达出目的蛋白酶。因此，我们要通过对转化涂布的平板设置阴性阳性的对照，结合菌落PCR验证及公司测序验证，筛选出可以表达出融合双酶体系的受体细胞来培养。紧接着，我们要做的就是粗酶的提取和酶活的测定了，收集菌体，重悬及离心等重复两次, 最后利用合适体积的缓冲溶液重悬菌体沉淀。超声破碎重悬后菌液, 获得粗酶液。4℃离心30 min 获取蛋白上清液进行酶活的测定, 取上清或沉淀以及粗酶液进行 SDS-PAGE 电泳。因为我们不仅仅要合成具有两种催化活性的多功能酶，而且要求它比两酶的简单耦合要具有更好的收率，否则导致试验不具有市场可行性。

本课题研究目的及意义，糖基转移酶广泛存在于生物中，是生物体内实现糖基化的主要酶类。本实验室构建的含糖基转移酶ZS1的大肠杆菌工程菌，能够催化酪醇糖基化合成红景天苷。该反应的关键性限制因素在于底物UDPG十分昂贵，而利用蔗糖合成酶SS构建辅酶循环体系，可以实现UDPG的循环再生。计划通过双酶融合体的构建，实现ZS1和SS双功能酶的表达，并对其酶学性质进行研究[15]。

参考文献