文 献 综 述

1.青霉素酰化酶的来源及分类

青霉素酰化酶最初从黄青霉(Penicillium Shrysogenum)Q176中发现^【1】，自然界中许多放线菌，细菌，真菌，酵母菌等也可产生青霉素酰化酶^【2】。但该酶的产生菌主要是杆菌及单孢菌^【3】，如：巨大芽孢杆菌、无色杆菌、醋酸杆菌、大肠杆菌、粘性节杆菌、巴氏醋酸杆菌、混浊醋杆菌、假单孢菌、产黑假单孢菌、坏死单孢菌等。有人对此进行了系统的总结，并将青霉素G钾盐裂解过程中起关键作用的酶统一定义为青霉素酰化酶，同时根据它们各自催化水解反应时对底物的优先性不同，又将它们分为主要的三大类：青霉素G酰化酶(PGA)， 青霉素V酰化酶(PVA)，苄基青霉素酰化酶(APCA)^【4】。

2.青霉素酰化酶的结构及催化机制

青霉素酰化酶是一种酰胺键水解酶，其系统名是青霉素氨基水解酶，PGA催化水解青霉素G时，亲核的丝氨酸攻击母核6-氨基青霉烷酸(以下简称6-APA)和苯乙酸侧链之间的酰胺键羰基碳原子，生成6-APA并且形成一种酰化酶。然后酰化酶被水解，生成苯乙酸和一个新的活化位点。对苯乙酰侧链以及涉及到对羟基苯甘氨酸降解的基因编码酶定位的研究表明，PGA能使苯乙酰混合物发生转化^【5】。研究显示．三维立体状的酶对苯乙酰及其衍生物有明确的结合位点，同时该酶也能结合其它的化合物，因为它能对相关侧链移动尤其是aAr9145和aPhel46构象发生转变起到作用。PGA也能用来在苄基内酰胺环上连接侧链，生成一种新的衍生物。该过程中，酶首先被该酰基侧链的酯或氨酰基化，然后被苄基内酰胺氨解，产生一个新的半合成抗生素。酰化酶也能与一个水分子反应而发生水解，同样抗生素产品也能被酰化酶水解，因此，目前很多研究都致力于降低这些水解反应来提高抗生素产量。

3青霉素酰化酶的特性

3．1 pH值稳定性

酶同其它蛋白质一样，分子中有许多极性基团。在不同的酸碱环境中，这些基团的游离状态不同，所带电荷也不同。只有当酶蛋白处于一定的游离状态下，酶才能与底物结合。许多底物或辅酶也具有离子特性(如ATP，NAD ，氨基酸等)，pH值的变化也影响它们的游离状态，同样可影响与酶的结合。因此，溶液的pH值对酶活性影响很大。若其他条件不变，酶只有在一定的pH值范围内才能表现催化活性。且在某一pH值时，酶的催化活性最大，此pH值成为酶作用的最适pH值。各种酶的最适pH值不同，但多数在中性、弱酸性、弱碱性范围内。

3.2热稳定性

热稳定性是衡量酶的工业用途大小的重要参数之一。对于大多数反应而言，升高温度有利于提高反应速度，保持系统热力学平衡，增大反应物溶解度和降低反应介质的粘度，但酶催化反应不可忽略酶不耐高温易失活的特性。研究表明，青霉素酰化酶(PA)的热稳定性与其在水中的构象互变性有关，这种互变性又与游离水分子的数量有关，所以可以通过降低酶分子周围游离水分子的量来提高其热稳定性。当前人们已经研究了许多提高PA热稳定性的方法，一般通过加入稳定剂来实现，如加入多元醇、聚乙二醇、中性盐、清蛋白或其它蛋白质、硫代乙酸还原剂和多羟基糖等。

4青霉素酰化酶的固定化

4．1固定化酶的优点

作为生物催化剂，酶对周围环境较为敏感，活性、稳定性容易发生改变。通常通过物理或化学方法将酶包埋或连接到载体上，制成固定化酶以提高酶的活性和稳定性。

固定化酶过去曾用过固相酶、水不溶性酶、不溶酶、固着酶等名称。1971年，第一届国际酶工程会议上，正式建议采用”固定化酶”(Immobilized ellzyme)的名称，用以表示”物理限制或定位在特定的空间区域内，保存了催化活性并可重复、连续使用的酶”。固定化酶通常具有很高活性和比活力，可以耐受杂质的污染并有较长的使用寿命，正是固定化酶的这种特性，才使许多实验室酶催化反应实现工业化生产成为可能。众多实验表明固定化酶与游离酶相比具有以下优点：

(1)固定化酶可以反复使用，大多情况下，稳定性较高，单位酶的生产力高；

(2)固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺，使产率产品质量提高；

(3)固定化酶反应时，条件容易控制，易于实现自动化生产；游离酶经固定化后引起酶性质的改变，可能原因有以下几种：(1)酶分子构象的改变；(2)微环境的影响；(3)底物在载体和溶液中存在着分配效应；(4)扩散效应。

4．2青霉素酰化酶固定化的方法

制备固定化酶的方法主要有吸附法、共价结合法、交联法、微生物包埋法等，不同的固定化方法、不同载体对酶性能的影响是不同的。

吸附法是利用载体表面与酶分子表面问的次级键相互作用而达到固定目的的方法，又可以分为物理吸附和离子结合法。物理吸附法是最古老的固定化方法。Chanh^【6】等利用硅藻土作为吸附载体对PGA进行固定，并对其动力学反应进行了研究，发现具有较高的回收率。离子结合法是指酶蛋白与载体通过离子键结合，将酶固定到具有离子活性基团的非水溶性载体上的一种方法。

共价结合法是在酶的非活性基团与载体的功能基团之间形成稳定的共价键，来使酶固定化到载体上。可与载体结合的酶的功能团有氨基、羟基、羧基、酚基等。韩辉等^【7】将巨大芽胞杆菌胞外青霉素酰化酶通过共价键结合到聚合物载体Eupergit C颗粒的环氧基团上，制成的颗粒状固定化青霉素酰化酶表观活力达1400μ/g左右，成功地获得了高活力的固定化青霉素酰化酶。

交联法即是利用双功能或多功能试剂在酶分子与载体间进行交联反应，通过形成共价键制备固定化酶的方法。鲜海军等^【8】用酸部分水解丙烯腈纤维为载体，以戊二醛为交联剂制备了固定化的胞外青霉素G酰化酶。这种固定化酶的活力达到2300 I．U／g，可以将浓度为2．5％～12．5％的青霉素G钾盐水解98％以上，其在室温中的半衰期长达130天。

包埋法是指将酶包埋于聚合物中的固定化方法，主要有以下几种类型：胶格包埋、微囊包埋和脂质包埋。用聚丙烯酰胺包埋青霉素G酰化酶^【9】，所得的固定化酶对头孢菌素G的最适pH值高达9．0，最适温度为50℃。固定化酶的pH值稳定性和热稳定性皆优于游离酶。可以应用于许多酶、微生物或细胞器的固定化。徐冠珠等将巨大芽孢杆菌胞外青霉素酰化酶通过共价键连接到醋酸纤维素载体上，制成的固定化青霉素酰化酶的宏观活力达2000 I．U左右(PDAB法)。水解10％(W／V)的青霉素G钾盐溶液，使用30批，保留活力70％以上^【10】。

参考文献

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微生物学报，2001，41(4)：475--479

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