1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

一、蛋白酶pt121简介

（1）蛋白酶pt121的概况

蛋白酶是一类重要酶类，可以用于洗涤及工业催化等诸多领域。金属蛋白酶pt121作为重要的工业酶可以催化多种小肽合成，然而作为重要的工业化蛋白酶表达量至今仍然较低，生产成本昂贵。本课题拟通过表达体系优化提高蛋白酶pt121的表达量。并对重组蛋白酶进行定向进化提高其催化阿斯巴甜的合成能力。来源于金属蛋白酶m4家族的蛋白酶pt121 (pseudolysin) 具有较高的稳定性，其中thermolysin表现出较高的温度耐受性，而pseudolysin由本实验室筛选到的来源于铜绿假单胞杆菌pseudomonas aeruginosa pt121所产蛋白酶^[1]，酶学性质上除了温度稳定性的优势外还具有较高的溶剂稳定性。

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

（1）研究思路

在现有的三种表达系统中，枯草芽孢杆菌和毕赤酵母菌与大肠杆菌中，只有大肠杆菌表达的蛋白质一般是不分泌到胞外的，而且经常是不溶的，但是大肠杆菌合成的蛋白质数量远超过前两系统的合成量。大肠杆菌合成的蛋白会在细菌内聚集成包涵体尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10%时，就很容易形成包涵体。生成包涵体的原因可能有是蛋白质合成快速太快，多肽链相互缠绕，缺乏使多肽链正确折叠的因素，导致疏水基因外露等。故很有必要设计载体使大肠杆菌分泌表达出可溶性目的蛋白，解决上述问题，但是表达量往往不高，可能lasb基因表达的蛋白酶pt121会对大肠杆菌有毒害作用，会影响细菌的生存繁殖，适当利用阿拉伯糖提高大肠杆菌的生长速度。

（2）研究内容