纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素K2的多阶段调控开题报告
2020-06-04 20:26:52
1. 研究目的与意义(文献综述包含参考文献)
1.维生素K2概述
1.1 维生素K2简介
维生素K2(menaquinones,甲萘醌)是一种脂溶性维生素,具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物,是人体中不可缺少的重要维生素之一。维生素K2在水果和普通食品里几乎不含有,因其尊贵故业界有”铂金族维生素”的美誉。它可预防肝硬化进展为肝癌;还可以治疗维生素K2缺乏性出血症,促进凝血酶原的形成,加速凝血,维持正常的凝血时间。并且维生素K2有多种结构式,最常见的有合成的menaquinone4(MK-4)和天然的menaquinone7(MK-7),对预防血管硬化[1-2],改善骨密度有着重要的作用。
图1. 维生素K2的结构式
1.2维生素K2的生理功能
维生素K2具有多种重要的生理功能:
1)预防肝硬化进展为肝癌
PDGFR是特异的蛋白酪氨酸激酶细胞表面受体,有2种亚型,即PDGFR-α和-β。在生长过程中,PDGFR-α参与增值、形态发生、上皮与间质的相互作用[3-4]。维生素K2可能通过下调PDGFR-的转录抑制肝癌细胞的增值[5-6]。
2)治疗维生素K2缺乏性出血症
当人体内遇到组织(如血管)出血时,会引起周围血小板破坏损伤,破坏受损的血小板就会立即释放出大量凝血因子;凝血因子在钙离子元素的参与下,再与凝血酶原结合生成凝血酶后,在凝血酶的作用下,促使血浆纤维蛋白原凝固变成纤维蛋白即凝血块;凝血块堵住出血伤口,从而达到止血的目的。而人体血液中的凝血酶原是在肝脏中合成,在合成过程中必须要有维生素K2的参与,否则无法合成。
3)治疗和预防骨质疏松症
维生素K2具有其独特的双向调节抗骨质疏松机制。
① 进骨矿化:骨钙素可以促进钙盐沉积[7-9],提高骨矿化速率,维持骨的正常钙化和结晶形成及软骨矿化速率,直接反映骨形成和骨重建。
②促进骨形成:维生素K2是骨特异基因转录调节剂,通过类固醇及异质物受体诱导成骨细胞标记物的表达,增强胶原蛋白的蓄积作用,改善骨质量,促进骨形成。
③抑制骨吸收:破骨细胞是能够吸收骨的唯一细胞,通过质子泵制造酸性环境引起骨钙溶解及组织蛋白酶溶解骨基质。
1.3维生素K2的应用
维生素K2主要应用在以下几个方面:
1)医药用品
由于维生素K2对骨骼和心血管疾病有良好效果,尤其是在骨骼健康方面,因此将维生素K2作为医药品开发,目的主要是预防骨折、肝硬化,强化肝脏的解毒功能并能降低血压,维生素K2缺乏性出血症。
2)食品工业
维生素K2属于营养强化剂,查GB 14880-2012可知,可以用在:
① 调制乳粉(仅限儿童用乳粉) 用量420μg/kg~750μg/kg;
② 调制乳粉(仅限孕产妇用乳粉) 用量340μg/kg~680μg/kg。
1.4维生素K2的来源
目前,维生素K2的来源主要有:
1)微生物法:自主选育的高产维生素K2生产菌株;分离纳豆提取物中的有效维生素K2获得 [10] 。
2)化学合成法:逆Diels-Alder法[11] ;F-C烷基化法[12];侧链延长法[13]。
目前,国内维生素K2都以化学合成法生产,但存在诸多缺点,如化学反应产生大量异构体、副产物多、化学前体原料来源限制、产率低、反应条件苛刻等,且合成的维生素 K2,其异戊二烯侧链多是顺式结构,活性较低。而国外(主要是日本)的学者对微生物法生产维生素K2作了大量的研究,对微生物法生产维生素K2的研究主要体现在菌种的诱变和发酵条件的优化上。采用微生物发酵法来进行维生素的工业化生产的优点在于能够大大简化生产工序并改善劳动条件,减少环境污染,同时也有利于资源开发和综合利用。而且发酵产生的维生素K2具有高生物活性和高生物相容性,易于人体吸收与利用。但从目前的文献看,发酵单位不高,发酵的成本较高,发酵周期也较长,因而成本也较高。如能通过多阶段调控发酵转速和温度策略以微生物发酵法生产维生素K2将有广阔的前景。
2.多阶段调控的研究进展
工业微生物菌种选育在发酵工业中占有重要的地位,而提高生产菌种的产物产量是菌种选育技术的最基本的任务。近年来对微生物法生产VKz的研究主要为菌种的诱变和发酵条件的优化,谷吉树等[14。15]以Flavobacterium sp.23827为亲株,通过NTG和紫外诱变得到抗HNA、抗解偶联剂松萝酸、抗维生素K3(甲萘醌,MK的结构类似物)的菌株K3215,优化培养条件后,MK的产量几乎是野生株的10倍,达到182 mg/L。
在我国的研究中,满在伟等人已经根据Perkins等人构建了基因工程菌株枯草芽孢杆菌RF1用于核糖体生产,除了引入生产性应变,在浸没培养和发酵培养基中的生物过程参数对于提高生产力和效率至关重要,利用最优生物过程参数和培养基组成,能显着提高产物和生物量产量。他们发现氧供应是枯草芽孢杆菌RF1产生核糖激素的关键因素,通过改变搅拌速度控制不同水平的DO浓度,在不同的氧气供应条件下比较枯草芽孢杆菌RF1的核糖体进料分批发酵的过程。在各种搅拌速度下如图2,显示在900rpm的搅拌速度下获得最高的DCW和核黄素浓度(14.5和7.8gl-1)。在600,700和800rpm的搅拌速度下的最终核糖蛋白浓度彼此非常相似(7.2#177;0.1gl-1)。此外,他们发现,在发酵过程的初始阶段,较低的搅拌速度(600rpm)有利于细胞生长和核黄素生物合成。而在后期阶段,较高的搅拌速度(900rpm)有利于细胞生长和核糖体生物合成。因此,基于动力学分析提出了两阶段搅拌速度控制策略,其中搅拌速度在第一个26小时内控制在600rpm,然后在整个发酵过程中切换到900rpm以维持高生产速率的细胞生长和高生产率的核糖体蛋白的生产。然而,观察到搅拌速度的急剧增加导致在短时间内对细胞生长和核黄素合成的不利影响。为了避免这种现象,基于两阶段控制策略建立了多级搅拌速度控制策略,在48小时内核糖激酶的最大浓度达到9.4gl-1,应用0.051gg-1的产率这种策略,比恒定搅拌速度控制的最佳结果是20.5和21.4%。
温度通过影响细胞膜的流动性和生物大分子的活性来影响微生物的生物活性,每一种微生物都有其最适的温度生长范围,在最适温度下,菌体可以较好地生长。钟青萍等
图2. 不同搅拌速度下枯草芽孢杆菌RF1产生核糖激素的时间过程 |
人[16] 对纳豆菌的抗菌作用进行了深入的研究,将纳豆菌分别在不同的温度下摇床振荡培养,结果如图3表明,培养温度对纳豆菌的生长影响不大,但对抗菌物质的产生有较大影响,当温度为25℃、30℃时,抗菌活性高。35℃以上时抗菌活性下降。董超等人[17]
图3. 培养温度对纳豆菌发酵的影响 |
图4. 不同温度下纳豆菌的发酵产酶曲线 |
芽孢杆菌的净生长量均有下降趋势。在温度处于30~40℃时,纳豆芽孢杆菌生长良好,菌数稳定增长,并且在该温度范围内净生长量相差不大,且纳豆芽孢杆菌产生纳豆激酶的产量最高,尤其是在37℃。
3.纳豆芽孢杆菌合成VK2的代谢机理
纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素K2是建立在对原核生物中MK的合成途径的认识基础之上的。在1982年,Bentley等就初步阐明了细菌内维生素 K2的生物合成机制,如图5所示,使我们对其合成途径有了初步认识。
图5. 维生素K2的生物合成途径
微生物以甘油为底物时首先在甘油激酶(CK)作用下形成 3-磷酸甘油,随后在磷酸甘油脱氢酶(NAD(P) )作用下氧化形成磷酸二羟丙酮,由此进入糖酵解途径(EMP途径)生成丙酮酸,丙酮酸脱羧形成乙酰-CoA,进入三羧酸循环途径(TCA途径)。同时,乙酰-CoA进入甲羟戊酸途径(MVA途径)形成聚异戊二烯焦磷酸(OPP);3-磷酸甘油进入磷酸戊糖途径(PPP途径),在转酮酶作用下形成4-磷酸赤藓糖,通过合成、脱水、脱氢形成莽草酸,最后反应生成分支酸;,由此进入MK途径。在menF、D、H、C、E、B基因簇编码的6种关键酶和水解酶作用下形成醌骨架1,4-二羟基-2-萘甲酸(DHNA),最后与MVA途径形成的聚异戊二烯焦磷酸在menA、UbiE/menC编码的转移酶作用下脱羧、甲基化形成甲萘醌。
4.本课题研究目的及意义
维生素K2作为一种生命活动必不可少的维生素,在医药、食品等领域具广泛地应用前景。在它的帮助下我们的身体能够利用钙质构造出坚硬的骨骼外层和海绵状的内部骨基质组织。而儿童、超过40岁的男女、老人这三类人恰恰最需要维生素K2来维持骨骼生长和心血管健康
纳豆芽孢杆菌Bacillussubtilis(natto)液体和固体(大豆)发酵生产的纳豆中产生大量VK2, 在每100克纳豆中含有870ug 维生素K2,纳豆中VK2的含量较之其他的食品要高得很多,是其他食品的数百倍,为当前主要的含VK2的食品。
在国内目前工业上的维生素K2大多都是以化学合成法生产,微生物发酵法生产虽然在研究,由于化学前体原料来源限制、化学反应产生大量异构体、产量太低、成本过高,不作为批量生产的主要途径。为了实现维生素K2的高产量和高生产强度,同时为了避免由于发酵条件瞬间的剧烈改变造成影响,本文在纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素K2的基础上提出通过多阶段调控发酵罐转速和温度策略[18],通过对比生物量,产量等等,获得高产量,从而为实现维生素K2的微生物发展的工业化奠定基础。
参考文献
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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案
研究解决的问题:
在国内目前工业上的维生素k2大多都是以化学合成法生产,微生物发酵法生产虽然在研究,由于产量太低,成本过高,不作为批量生产的主要途径。本文纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素k2的基础上提出多阶段调控转速和温度策略,通过对比生物量,产量等,获得高产量,从而为实现维生素k2的微生物发展的工业化奠定基础。
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