文 献 综 述

一、研究背景

1、赤霉菌的背景

赤霉素，是一种天然的植物生长调节剂。属于生物体内的一类四环二萜类化合物。它与生长素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯称为植物五大激素。主要对植物生长具有多种生理功能，例如通过调节水解酶活性从而调控种子发芽、茎干延长、诱导开花、打破休眠、性别分化等过程。因而赤霉素广泛应用于农业、林业、酿造业等。赤霉素不仅分布于绿色植物，在一些细菌和真菌中也有发现。目前获取赤霉素主要方式有三种：植物中提取，化学合成，微生物发酵。由于前两种方法价格昂贵、效率低下，而微生物发酵法具有产量高、成本低等优点 ，所以工业大规模生产赤霉素主要通过微生物发酵法。目前用于工业化生产的微生物主要是是丝状真菌藤仓赤霉（Fusarium fujikuroi）。但目前价格高依旧是阻碍赤霉素大规模应用的主要障碍。因而必须通过菌种改良、发酵工艺优化、下游提取优化等方法提高赤霉素产量，降低赤霉素的价格，以促进赤霉素的全面推广。本课题主要通过最新的基因编辑技术crispr/cas9对赤霉菌基因组进行编辑，定向改造藤仓赤霉菌成为高产菌株，提高产量。

水稻恶苗病原菌赤霉菌(Gibberella fujikuroi)因产赤霉(Gibberellins , GAs)而闻名。目前, 在植物、真菌和细菌中已经鉴定的赤霉素烷类化合物已达126 种。其中GA3 、GA4 、GA7 和GA9 等可作为天然植物激素有效控制植物种子萌发过程中水解酶活性的诱导、茎的伸长、花的诱导和种子发育等植物生长发育过程^[1]。正是由于这些特性和其商业利用价值, 曾经投入了大量的人力和物力进行赤霉素的开发应用研究。尤其过去10 年中, 伴随着分子生物学方法技术的渗透与应用, 在赤霉菌分子生物学研究方面取得了许多进展^[2]。

GA 合成缺陷突变株的研究最早始于20世纪50年代,最有名的突变体是Bearder 等^[3]采用UV诱变法以野生型菌株GF_1a为出发菌株得到的突变体B1_41a ,该菌株不能氧化内根_贝壳杉烯醛(ent_kaur_16_en_19_al)产生内根_贝壳杉烯酸(entkaur_16_en_19_oic_acid), 使内根-贝壳杉烯的氧化发生遗传阻断。Candau 等^[4]采用亚硝基胍(N_methyl_N_nitro_N_nitrosogluanidine)诱变野生型赤霉菌菌株IMI58289得到了GA合成途径不同反应点发生阻断的缺陷突变株SG121、SG136、SG138和SG139 ,为了解赤霉菌中赤霉素的代谢途径提供了有利的实验材料。Krasnopolskaya 等^[5] 也曾通过从野生型菌株的菌丝体制备原生质体并使之再生筛选出了倾向于合成GA4或GA7的菌株。

这些突变体在赤霉素生物合成途径研究、基因的克隆、鉴定、表达及功能等研究中起着非常重要的作用, 也是获得改良菌株、提高赤霉素产量的有力工具。

2、赤霉素生物合成的分子机理

在过去50多年的研究中,对赤霉菌中赤霉素合成的基本途径已经相当清楚,但对赤霉素合成途径的生物化学反应过程并不明了。随着赤霉菌分子生物学研究的深入,参与赤霉素生物合成的特异性基因已经全部被克隆定位, 并对所有基因的功能进行了详细研究^[6,7] 。赤霉菌中赤霉素合成的生物化学反应机制从而得以阐明:由羟甲基戊二酰辅酶A 在3_羟基_3甲基_戊二酰CoA 还原酶作用下生成甲羟戊酸,经异戊烯基二磷酸(IDP)、香叶儿二磷酸(GDP), 由法尼基二磷酸(FDP)合成酶催化GDP 生成FDP;FDP 在香叶儿香叶儿二磷酸(GGDP)合成酶作用下转化成GGDP;GGDP 在赤霉素合成特异性基因cps ks 编码的CPS KS 双功能合成酶催化下, 经过两步环化反应经由柯王巴内酯焦磷酸(Copaly l diphosphate)转化成内根_贝壳杉烯, 该反应是赤霉素合成途径中特异性的关键步骤并被认为是真菌中赤霉素生物合成的限速步骤^[2] 。然后高度疏水的内根-贝壳杉烯被P450_4 编码的多功能内根_贝壳杉烯氧化酶连续催化, 经内根-贝壳杉烯醇、内根-贝壳杉烯醛而氧化成内根-异贝壳杉烯酸^[6,8] 。内根-异贝壳杉烯酸在多功能细胞色素P450_1 单氧化酶连续催化作用下, 经内根-7α_羟基-异贝壳杉烯酸、GA12 -醛(赤霉素代谢途径中第一个内根-赤霉素烷类化合物)、GA14 -醛到GA14^[8，9,10] 。之后, GA14 在P450_2 催化下转化成GA4 , GA4 在orf3 des 编码的GA4 1, 2_脱氢酶作用下氧化成GA7 或在P450_3催化下转化成GA1 。GA7 在P450_3 催化下转化成GA3^[2,8,11] 。

3、hmgR以及cps/ks基因在赤霉素表达过程中的关键作用