毕业设计(论文)任务书

2017 年 1 月 12 日

文 献 综 述

核苷及其衍生物在抗病毒和抗肿瘤方面的作用近年来越来越引起人们的关注。核苷化合物是由核糖或脱氧核糖在其位连一个碱基（嘌呤或嘧啶）后形成的一系列化合物的统称。因其碱基和核糖基团存在着多种修饰,造成此类化合物种类繁多,在药物、食品和生化试剂领域应用广泛,并成为抗病毒、抗癌药物的重要来源。核苷类药物是核苷化合物的衍生物，是临床上用于治疗病毒感染性疾病、肿瘤、艾滋病的一类重要的药物。在目前使用的抗病毒药物中近50%是核苷类药物^[1]。许多核苷类药物,如齐多夫定、利巴韦林、拉米夫定、卡培他滨等均在临床上得到广泛应用。

目前大多数被批准使用的抗病毒药是天然核苷的类似物,它们通过干扰受感染细胞中核酸合成而使病毒复制受到抑制。这些核苷类似物在抑制核酸合成前先在细胞中被磷酸化为5'-单磷酸和5'-二磷酸核苷,并进一步活化成具有活性的5'一核苷三磷酸。这种激活受宿主细胞或病毒诱导酶控制,若由前者引起就会有较高毒性,由后者引起则反之。例如,阿昔洛韦由于受病毒编码的鸟苷激酶所催化,不被宿主细胞的酶磷酸化,故对宿主细胞表现出较低毒性^[7]；齐多夫定能有效阻止病毒链的聚合反应，得到广泛使用。目前通过人们的努力产生了一系列具有很强抗病毒活性的新型核苷类似物，如地丹诺辛，扎西他宾，司他夫定，拉米夫定，治疗疱疹病毒感染的阿昔洛韦、泛昔洛韦治疗单纯疱疹、脑炎的阿糖腺苷；治疗流感、疤疹、丙型肝炎的利巴韦林等。大量临床试验己经表明,这些核苷类似物对于病毒的逆转录酶有强的抑制效力。

核酸类抗癌药物则通过：（1）在细胞内代谢成活性成分,抑制核苷酸从头合成途径中的相关酶,起到干扰dNTP”池”的作用,从而抑制DNA复制；（2）被代谢成相关的核普三磷酸插入到或链中,中止链的合成及延伸；（3）抑制核酸合成的相关酶,如聚合酶和核酸还原酶等酶类,从而抑制核酸大分子的合成和修复^[7]。核苷类似物的化学结构与天然核苷有着不同程度的相似性，在细胞代谢中，可与正常核苷形成竞争关系，具有干扰核酸的合成及抑制相关聚合酶结合的作用，进而阻断肿瘤细胞和病毒的复制。目前常用的嘌呤核苷抗癌药物有氟阿糖腺苷酸、2#8217;-脱氧助间型霉素、2#8217;-氯脱氧腺苷、以及8-氯腺苷。

核苷类似物是抗癌、抗病毒药物取之不竭的资源库，大量经过修饰的碱基和核苷都有可能成为有用的物质。核苷类似物的合成主要有化学合成法、酶法和发酵合成法3种方法。核苷类药物传统的制造方法一般采用化学合成,此方法缺点是步骤多、难度高、周期长且有异构体产生。例如要对天然核苷进行化学修饰,往往需要先对碱基或核糖基团进行保护,此后还要去除保护基团,这样合成反应总收率将会降低。用化学法将碱基与核糖缩合,还可能形成α-异构体,影响产率^[1]；且化学催化剂对人体和环境毒害大。而酶法合成核苷则具有工艺简单,反应条件温和,成本低,收率高,且不易造成环境污染等优点,应用酶法合成核苷将是大势所趋，高效酶法合成更是至关重要。

核苷磷酸化酶在核酸和核苷的代谢过程中起着重要作用，已被广泛用于酶法合成抗肿瘤、抗病毒的核苷类似物。核苷磷酸化酶广泛分布于动植物器官及微生物中,它们在补救途径中催化核苷或脱氧核苷的糖苷键的可逆磷酸化反应,提供核糖-1-磷酸,并释放出碱基,加入其他碱基可形成另一种新的核苷^[3]。现己发现该酶分为四种：嘌呤核苷磷酸化酶,嘧啶核苷磷酸化酶,胸苷磷酸化酶,尿苷磷酸化酶。利用核苷磷酸化酶已成功合成了阿糖腺苷、2ˊ-脱氧腺苷、三氮唑核苷、5－氟尿苷等。但利用含有核苷磷酸化酶的天然菌株合成核苷类药物存在酶量小的缺点，构建基因工程菌的方法可从根本上解决酶量问题。

2,6一二氨基嘌呤核苷是一种具有抗肿瘤作用的核苷类似物，其合成可采用化学合成法，采用尿苷和2,6-二氨基嘌呤进行缩合，得到α、β同分异构体,然后去掉保护基团后,再进行分离。此外用重组核苷磷酸化酶酶法合成也可得到。本实验以来源于米氏硫胺素芽孢杆菌中的核苷磷酸化酶为生物催化剂，以尿苷，2,6二氨基嘌呤为底物来实现2,6-二氨基嘌呤核苷的酶法合成。其过程是酶的活性端和磷酸基团稳定了反应过程中形成的高能过渡态。在反应中,使磷酸单阴离子脱去质子形成磷酸双阴离子,然后磷酸双阴离子通过静电作用使糖苷键发生极化,断键,形成氧碳正离子产生的氧碳正离子和磷酸双阴离子络合,形成一个稳定的中间体，从而发挥酶的高效催化能力^[7]。

核苷类物质常通过半合成法获得。酶法合成核苷时常常不提取酶，直接使用菌体作为酶或简单地将细胞溶解，因为菌体可以在低温下长期保存或风干保存。此外在较低温度反应时，可加入10%乙二醇抑制脱氨酶^[13]。还有大多数情况下酶和细胞都只利用一次，因为存在酶或细胞与产物和底物分离频繁的问题，所以近年有不少文献报道直接固定化完整微生物细胞合成得到核苷，在此基础上的酶的反应稳定性得到大大的提高。

应用酶法生产各种核苷类药物有着广阔的前景。虽然酶法合成核苷类药物起步较晚，还有大量的工作要做，如提高反应物浓度、筛选合成的菌种、对生产菌种进行基因水平的改造等，但由于能使许多复杂和难以进行的有机化学反应变得简单易行，且大幅度降低生产成本，这将大大促进各种核苷药物的开发^[4]。

参考文献：

[1] 夏俊刚, 何逵夫, 谢希贤,等. 枯草芽孢杆菌嘌呤核苷磷酸化酶酶学性质研究及在利巴韦林酶法合成中的应用[J]. 中国生物工程杂志, 2010, 30(12):53-59.

[2] 吴晓, 倪孟祥, 朱晓丽,等. 利用嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌酶法合成5-氟尿苷的转化率影响因素的研究[J]. 药物生物技术, 2008, 15(4):282-285.

[3] 高彤, 李文舟, 梁胜华,等. 基因工程菌酶法合成抗癌新药6-甲基嘌呤-2'-脱氧核苷[J]. 工业微生物, 2007, 37(1):8-13.

[4] 郭勇莉, 丁庆豹, 欧伶,等. 酶法合成抗病毒药物阿糖腺苷[J]. 生物技术, 2006, 16(1):32-35.

[5] 易喻, 江林林, 梅建凤,等. 酶法合成2#8217;-脱氧-5-氟尿苷的研究[J]. 药物生物技术, 2015(1):9-13.

[6] 李喻, 窦洁, 曹静,等. 乙酰短杆菌酶法合成2′-脱氧鸟苷[J]. 药物生物技术, 2011(2):119-123.

[7] 丁庆豹，核苷磷酸化酶的克隆、表达与应用.生物化工，2010,9

[8] Zhou X, Mikhailopulo I A, Bournazou M N C, et al. Immobilization of thermostable nucleoside phosphorylases on MagReSyn 庐;, epoxide microspheres and their application for the synthesis of 2,6-dihalogenated purine nucleosides[J]. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic, 2015, 115:119-127.

[9] Zhou X, Szeker K, Jiao L, et al. Synthesis of 2,6‐Dihalogenated Purine Nucleosides by Thermostable Nucleoside Phosphorylases[J]. Advanced Synthesis amp; Catalysis, 2015, 357(6):1237-1244.

[10] Zhu S, Song D, Gong C. Biosynthesis of nucleoside analogues via thermostable nucleoside phosphorylase[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(15):6769-78.

[11] Iglesias L E, Lewkowicz E S, Medici R, et al. Biocatalytic approaches applied to the synthesis of nucleoside prodrugs.[J]. Biotechnology Advances, 2015, 33(5):412-434.

[12] Bagarolo M L, Porcelli M, Martino E, et al. Multiple disulfide bridges modulate conformational stability and flexibility in hyperthermophilic archaeal purine nucleoside phosphorylase[J]. Biochimica et biophysica acta, 2015, 1854(10 Pt A):1458.

[13] Fern#225;ndez-Lucas J, Fresco-Taboada A, De l M I, et al. One-step enzymatic synthesis of nucleosides from low water-soluble purine bases in non-conventional media.[J]. Bioresource Technology, 2012, 115(115):63-9.

[14] Vande V J, Liekens S, Mcguigan C, et al. The cytostatic activity of NUC-3073, a phosphoramidate prodrug of 5-fluoro-2'-deoxyuridine, is independent of activation by thymidine kinase and insensitive to degradation by phosphorolytic enzymes.[J]. Biochemical Pharmacology, 2011, 82(5):441-52.

[15] Serra I, Bavaro T, Cecchini D A, et al. A comparison between immobilized pyrimidine nucleoside phosphorylase from Bacillus subtilis, and thymidine phosphorylase from Escherichia coli, in the synthesis of 5-substituted pyrimidine 2′-deoxyribonucleosides[J]. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic, 2013, 95:16-22.

毕业设计(论文)任务书