1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1．青霉素酰化酶概述

1.1青霉素酰化酶简介

青霉素酰化酶(penicillin acylase，EC3.5.1.11)又称为青霉素氨基酰化酶，是一种N末端亲核丝氨酸水解酶。该酶在酸性以及中性条件下，可用于催化6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基脱乙酰头孢烷酸(7-ADCA)与酰基供体发生酰基化反应，制备半合成抗生素；而在偏碱性条件下，催化青霉素G（penicillin G)水解成为6-APA和苯乙酸（PAA)，而6-APA是大量制备半合成β-内酰胺抗生素所需要的重要母核。因此，青霉素酰化酶在医药工业中是一种非常重要的酶，在生产新型抗生素方面也有着很高的价值。

1.2 青霉素酰化酶研究水平的概述

1.2.1国内研究水平概况

β-内酰胺抗生素经过多年的发展, 已成为抗生素中的最主要类型之一。由于具有良好的抗菌效力, 较低的毒副作用, 在临床上广泛应用, 其发展非常迅速。我国酶法合成研究起步并不晚, 但至今仍未形成大规模工业化生产, 与国外先进厂家差距较大。随着我国经济快速发展, 人们对自身居住环境的要求, 政府对环保的重视, 政府和越来越多的企业加大”绿色化学制药”的研究开发, 特别是加快工业化生产的推进进程。现将近年来 β-内酰胺抗生素合成研究、产品的分离纯化、酶反应器研究进行概述。

1.2.2青霉素酰化酶的应用

与热力学控制相比，动力学控制的反应(见图1-1)要复杂得多，在反应中必须提供活化的酰基供体，在合成体系中主要存在以下三个反应：(1) β-内酰胺抗生素产物的生成；(2)活化酰基供体的水解反应；(3)合成的抗生素的水解反应^[1]。Maxin^[2]等将苯甘氨酸甲酯在青霉素酰化酶作用下，与6-APA缩合生成氨苄青霉素。表1-1列举了青霉素酰化酶催化合成的一些β-内酰胺类抗生素及其所对应的底物^[3]。

图1-1 动力学控制合成的模式^[1]

2. 青霉素酰化酶活力的测定^[4]

由于人工底物的分光光度法检测灵敏度高，不易受干扰，操作方便，因此本实验采用2-硝基-5-苯乙酰胺基苯甲酸(NIPAB)为底物的比色法进行青霉素酰化酶酶活的测定。青霉素酰化酶作用于NIPAB，生成5-氨基-2-硝基苯甲酸(ANBA)。因为ANBA在405nm波长下有最大吸收，所以通过测定反应过程中生成的ANBA的微摩尔数来确定青霉素酰化酶活力。

3. 在半合成β-内酰胺类抗生素合成中的应用

早在1960年，Kaufmann^[5]等就发现在酸性条件下，青霉素酰化酶可以催化6-APA和苯乙酸合成青霉素G。如今，青霉素酰化酶已被广泛地应用于半合成β-内酰胺类抗生素的合成研究中。其中研究较多的有氨苄青霉素、头孢氨苄和阿莫西林。Diender^[6]等研究了热力学控制阿莫西林酶法合成，在水溶液中加入来源于E.coli的青霉素酰化酶，同时加入有机溶剂，提高阿莫西林的合成平衡常数和合成收率。

在偏酸性条件下，青霉素酰化酶可以催化母核6-APA和侧链苯乙酸合成青霉素G。如今，青霉素酰化酶已被广泛应用于半合成β-内酰胺类抗生素的研究中。其中，研究较多的有氨苄青霉素^[7]、头孢氨苄、头孢羟氨苄和阿莫西林^[8]。

合成青霉素G的抗生素催化酰基转移酶，评估和优化不同的合成方法^[9] :酰基转移酶合成头孢菌素^[10]；设计一个高效的催化剂合成头孢菌素^[11]；高效的大规模合成头孢菌素的生物催化剂，通过结合固定化和青霉素酰基转移酶的定点诱变^[12]。

青霉素酰化酶以其良好的催化酰化/去酰化特性受到了广泛关注，青霉素酰化酶不仅医药工业上用于大规模生产β-内酰胺类抗生素中间体和半合成β-内酰胺类抗生素，还有其他一些潜在应用，如在肽的合成过程中用于保护氨基和羟基， 以及用于手性化合物的拆分等。因此，各国科研人员对青霉素酰化酶的研究热情不减^[13]。

4. 本研究的意义

半合成β-内酰胺类抗生素是临床上抑制细菌感染的首选药物，但是由于其大规模使用，导致了越来越多的细菌对其产生耐药性，要解决这个问题就需要开发新的半合成抗生素。与传统的化学法合成相比，酶法合成β-内酰胺类抗生素具有反应步骤少，废弃物产生少，有利于环境保护，生产成本降低，产品杂质少、易分离且质量优异等诸多优点。因此，β-内酰胺抗生素的酶法合成是21世纪β-内酰胺抗生素发展的趋势之一^[14]。

到目前为止，青霉素酰化酶的研究表明木糖氧化无色杆菌来源的青霉素酰化酶具有较好的热稳定性以及优良的合成抗生素能力，因此本研究对实验室自行筛选得到的木糖无色杆菌来源的PGA进行了酶学性质研究，其中pH稳定性以及温度稳定性、有机溶剂的耐受性对在合成条件的选取具有重要意义；并后续对其合成头孢羟氨苄的一些条件进行研究，为了证明此PGA也具有较好的合成活性。

参考文献

[1] Illanes A, Altamirano C, Fuentes M, et al. Synthesis of cephalexin in organic medium at high substrate concentrations and low enzyme to substrate ratio[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2005, 35(1): 45-51.

[2] Maxin I Youshko, Luuk M van Langen, et al. Penicillin acylase-catalyzed synthesis of amipicillin in ”aqueous solution-precipitate”system.high substrate concentration and supersaturation effect [J]. J Mol Catal B:Enzym, 2000, 10: 509-515.

[3] Terreni M, Tchamkam J, Sarnataro U, et al. Influence of Substrate Structure on PGA-Catalyzed Acylations. Evaluation of Different Approaches for the Enzymatic Synthesis of Cefonicid[J]. Advanced Synthesis amp; Catalysis, 2005, 347(1):121#8211;128.

[4] 施晓疌, 王永红, 张嗣良, 等. NIPAB法测定青霉素G酰化酶活力的分析和改进 [J]. 中国医药工业杂志, 2008, 39(9): 659-661.

[5] Van Langen L M, Oosthoek N H P, et al. Penicillin acylase catalysed of ampicillin in hydrophilic organic solvents [J]. Biochem J, 1969, 115(4): 733-739.

[6] Diender M B, Straathol A J J, et al. Course of pH during the formation of amoxicillin by suspension-to-suspesion reaction [J]. Enzyme Microb Technol, 2000, 27: 576-582.

[7] Illanes A, Wilson L, Corrotea O, et al. Synthesis of cephalexin with immobilized penicillin acylase at very high substrate concentrations in fully aqueous medium [J]. J Mol Catal B:Enzym, 2007, 47(1-2): 72-78.

[8] Goncalves L R B, Sousa R Jr, Fernandez-Lafuente R, et al.Enzymatic synthesis of amoxicillin avoiding limitations of the mechanistic approach for reaction kinetics [J]. Biotechnol Bioeng, 2002, 80(6): 622-631.

[9] Fern#225;ndez-Lafuente R, Rosell C M, Piatkowska B, et al. Synthesis of antibiotics (cephaloglycin) catalyzed by penicillin G acylase: Evaluation and optimization of different synthetic approaches [J]. Enzyme amp; Microbial Technology, 1996, 19(1):9-14.

[10] Terreni M, Ubiali D, Bavaro T, et al. Enzymatic synthesis of cephalosporins. The immobilized acylase from Arthrobacter viscosus: a new useful biocatalyst. [J]. Applied Microbiology amp; Biotechnology, 2008, 77(3):579-87.

[11] Bazzini C, Brovelli S, Caronna T, et al. Characterization and study of the orientation of immobilized enzymes by tryptic digestion and HPLC-MS: design of an efficient catalyst for the synthesis of cephalosporins. [J]. Biomacromolecules, 2010, 11(6):1623-32.

[12] Cecchini D A, Pavesi R, Sanna S, et al. Efficient biocatalyst for large-scale synthesis of cephalosporins, obtained by combining immobilization and site-directed mutagenesis of penicillin acylase.[J]. Applied Microbiology amp; Biotechnology, 2012, 95(6):1491-500.

[13] Franti#353;ek #352;krob, Stanislav Be#269;ka, Kamila Plh#225;#269;kov#225;, et al. Novel penicillin G acylase from Achromobacter, sp. CCM 4824[J]. Enzyme amp; Microbial Technology, 2003, 32(6):738-744.

[14] Be#269;ka S, #352;těp#225;nek V, Vyasarayani R W, et al. Penicillin G acylase from Achromobacter sp. CCM 4824: an efficient biocatalyst for syntheses of beta-lactam antibiotics under conditions employed in large-scale processes. [J]. Applied Microbiology amp; Biotechnology, 2014, 98(3):1195-203.

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

解决的问题：