论文总字数：24375字

摘 要

低聚果糖（Fructooligosaccharide,简称 FOS）是指在蔗糖的果糖基上通过β-2,1或β-2,6糖苷键连接 1~3个果糖而形成的蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖（GF4）及其混合物，是公认典型的益生元，能改善肠道菌群，提高免疫力与健康水平。近年来，β-2，6糖苷键连接的低聚果糖因具有更优的益生元及生理特性而受到越来越多关注，但是由于已报导的酶法催化合成β-2，6键型低聚果糖的转化率都普遍较低，所以其还没有应用到实际。本实验室自行筛选获得Arthrobacter arilaitensis NJEM01来源的β-呋喃果糖苷酶，能够催化蔗糖特异性合成β-2，6键型的低聚果糖。

本课题以多官能团修饰的大孔树脂为载体，对β-呋喃果糖苷酶进行固定化实验，得到了高回收率的固定化酶，不仅使其稳定性得到了改善，而且使得β-2，6键型低聚果糖的转化率得到了提高。具体研究如下：

1.通过实验比较了修饰上不同基团的大孔树脂载体对FFase固定化的效果，发现以Am-glyoxyl修饰的大孔树脂固定化效果最优，其酶活回收率最高可达95%。对固定化过程进行优化，在吸附时间6 h，温度25 ℃，加酶量40 U的最佳固定化条件下，得到了酶活力205.7 U/g，蛋白吸附量7.8 mg/g的固定化果糖苷酶。

2.固定化果糖苷酶催化合成低聚果糖的最优条件为：催化pH 8.0，催化温度40 ˚C，加酶量2 U/g蔗糖，底物蔗糖浓度1.5 M。在此条件下，当反应时间为24 h时，低聚果糖产量最高，为360 g/L，转化率达72%（w/w）。

关键词：β-呋喃果糖苷酶 β-2，6型低聚果糖 大孔树脂 多官能团固定化

Modified macroporous resin immobilized β-fructofuranosidase

Catalytic preparation of novel oligofructose

Abstract

Fructooligosaccharide (FOS) refers to canetriose (GF2) and cane fruit formed by linking 1 to 3 fructose by β-2,1 or β-2,6 glycosidic bonds on the fructose group of sucrose. Tetrasaccharide (GF3), sugar cane pentasaccharide (GF4) and mixtures thereof are recognized as typical prebiotics.In recent years, β-2,6 glycosidic-linked oligofructose has received increasing attention due to its superior prebiotics and physiological properties. However, due to the reported enzymatic synthesis of β-2,6-bonded oligofructose, the conversion rate is generally low,so it has not been applied to practice.The laboratory self-screening to obtain the β-fructofuranosidase derived from Arthrobacter arilaitensis NJEM01,can specifically synthesize β-2, 6-bond fructose oligosaccharide with sucrose as substrate.

In this study, a multi-functionalized macroporous resin was used as a carrier to immobilize the enzyme, and a highly recovered immobilized enzyme was obtained, which not only improved its stability, but also made β-2, 6 bond type. The conversion rate of oligofructose has been improved. The specific research is as follows:

1.The effect of macroporous resin carrier modified with different groups on the immobilization of FFase was compared by experiments. It was found that the macroporous resin modified by Am-glyoxyl had the best immobilization effect, and the recovery of enzyme activity was up to 95%.The immobilization process was optimized. Under the optimal immobilization conditions of adsorption time 6h, temperature 25 °C and enzyme dosage 40U, the immobilized fructosidase with enzyme activity 205.7U/g and protein adsorption capacity 7.8mg/g was obtained.

2.The optimal conditions for the synthesis of oligofructose catalyzed by immobilized fructosidase are: catalytic pH 8.0, catalytic temperature 40 ̊C, enzyme addition 2 U/g sucrose, substrate sucrose concentration 1.5M.Under these conditions, when the reaction time was 24h, the yield of oligofructose was the highest, 360g/L, and the conversion rate was 72% (w/w).

Key words: β-fructofuranosidase; β-2,6-type oligofructose; macroporous resin; polyfunctional immobilization

目 录

摘要 I

Abstract II

目 录 IV

第一章 文献综述 1

1.1低聚果糖概述 1

1.1.1 低聚果糖结构与分类 1

1.1.2 低聚果糖理化性质 2

1.1.3低聚果糖生理功能 2

1.1.4 低聚果糖应用 2

1.2 β-呋喃果糖苷酶概述 3

1.2.1 β-呋喃果糖苷酶简介 3

1.2.2 β-呋喃果糖苷酶合成不同构型FOS进展 3

1.3酶固定化的研究 4

1.3.1 酶的经典固定化 4

1.3.2 酶的新型固定化 5

1.4 大孔树脂固定化β-呋喃果糖苷酶的研究 6

1.4.1 固定化果糖苷酶的研究 6

1.4.2大孔离子交换树脂的选用 6

1.5 本课题的研究内容和意义 7

1.5.1研究内容 7

1.5.2研究意义 7

第二章 果糖苷酶大孔树脂固定化条件的研究 8

2.1 材料与仪器 8

2.1.1 菌株与培养基 8

2.1.2 实验制剂 8

2.1.3 主要仪器设备 9

2.2 实验方法 9

2.2.1 多官能团大孔树脂载体的表面修饰 9

2.2.2 果糖苷酶的固定化 11

2.2.3 多官能团树脂乙醛基共价效果验证 11

2.2.4 酶活测定及蛋白浓度检测方法 11

2.2.5 Fru6固定化参数计算方法 12

2.2.6 固定化条件的优化 12

2.3 结果与讨论 12

2.3.1多官能团固定化效果比较 12

2.3.2 Amino-glyoxyl-MI-BN4固定化效果验证 13

2.3.3乙醛基固定化效果验证 14

2.3.4 固定化过程优化 14

2.4本章小结 16

第三章 固定化果糖苷酶催化合成低聚果糖条件研究 17

3.1实验材料 17

3.1.1实验试剂 17

3.1.2实验仪器 17

3.2实验方法 17

3.2.1 温度对固定化酶催化合成FOS的影响 17

3.2.2 pH对固定化酶催化合成FOS的影响 18

3.2.3 加酶量对固定化酶催化合成FOS的影响 18

3.2.4 底物浓度对固定化酶催化合成FOS的影响 18

3.2.5 重复催化合成FOS 18

3.3 结果与讨论 18

3.3.1 温度对于固定化果糖苷酶催化合成FOS的影响 18

3.3.2 pH对于固定化果糖苷酶催化合成FOS的影响 19

3.3.3 加酶量对于固定化果糖苷酶催化合成FOS的影响 20

3.3.4 底物浓度对于固定化果糖苷酶催化合成FOS的影响 21

3.3.5 重复催化合成低聚果糖 22

3.4本章小结 22

第四章 结论与展望 23

4.1结论 23

4.2展望 23

参考文献 24

第一章 文献综述

近年来，益生元食品因其具有改善人体健康的功能而受到越来越多消费者的欢迎，常见的益生元有低聚果糖（FOS），低聚半乳糖（GOS），异麦芽低聚糖（IMO），低聚木糖（XOS）和改性大豆低聚糖等^[1]。其中低聚果糖是第一个通过 FDA审核的、公认安全级 (GRAS) 的功能性低聚糖，可用作甜味剂和食品添加剂^[2]，具有改善肠道功能、促进矿物质吸收、降低胆固醇和血脂等多种功能，近几年被广泛应用于保健食品、医药、饲料等领域。许多植物果蔬例如大麦、香蕉、西红柿、蜂蜜等中都含有低聚果糖，但因含量较低且难以提取，所以目前主要采用微生物酶法合成低聚果糖^[3,4]。不同来源的酶催化合成的低聚果糖构型不同，功效也有一定差异。研究发现β-2,6 糖苷键连接的低聚果糖比传统的β-2,1 键连接的商业低聚果糖具有更优的益生元性能和生理特性^[5]，但目前已报导的β-2,6 型低聚果糖转化率都普遍较低，且产物中一般混合有其余键型的低聚果糖，所以由β-2，6糖苷键连接的低聚果糖还没有应用到实际。本实验室已通过分子改造技术得到了可以高效催化合成β-2,6 型低聚果糖的β-呋喃果糖苷酶，如何提高其稳定性和重复利用性来将其应用到工业生产中就成了研究的热点。

1.1低聚果糖概述

低聚果糖结构与分类

图1-1 几种构型的蔗果三糖化学结构

根据单糖残基之间连接键型的不同，低聚果糖分为三种类型，分别是菊粉型FOS（¹F-FOS）、果聚型FOS（⁶F-FOS）以及neoFOS（⁶G-FOS），结构如图1-1所示。¹F-FOS是β-2,1 糖苷键连接的线性低聚糖；⁶F-FOS是β-2,6 糖苷键连接的线性低聚糖；⁶G-FOS则是β-2,6 糖苷键连接的非线性低聚糖。

1.1.2 低聚果糖理化性质

1. 甜度

低聚果糖具有非常低的甜味强度，约为蔗糖的三分之一，且味道更为醇正，甜味清爽、无后味。

2. pH值与热稳定性

在低温下，pH对低聚果糖的稳定性影响不大；在中性环境中，即使加热至120 ˚C低聚果糖仍很稳定；但在pH值低于4.0的酸性环境中，当温度高于70 ˚C，低聚果糖稳定性显著降低，甚至易分解。

1.1.3低聚果糖生理功能

低聚果糖具有多种益生元功能：（1）双向调节肠道菌群：促进肠道内有益菌如双歧杆菌、乳酸杆菌等的生长繁殖并抑制致病菌或腐败菌的繁殖，减少致癌物、有害代谢物等在肠道内的积累并促进肠道蠕动^[6]（2）促进矿物质吸收，在一定程度上预防骨质疏松和促进发育^[7]（3）降低血脂和胆固醇（4）抗龋齿作用等。

1.1.4 低聚果糖应用

低聚果糖被誉为21世纪健康新糖源，已被广泛应用于食品、医药、化妆品、动物饲料等领域^[8]。低聚果糖可作为低龋齿糖的替代品，有效防止龋齿。当食品非常甜时，低聚果糖可以与甜味较重的人造甜味剂如阿斯巴甜、苯丙氨酸、三氯蔗糖等一起用作增量剂。此外，低聚果糖还有助于保湿软烤制品，降低冷冻甜点的冰点，为低脂肪曲奇提供脆度，代替其余高卡路里的糖类充当燕麦棒的粘合剂。目前添加低聚果糖的食品已经从1992年的200多种增加到530多种，其中乳制品的耗用量达60%^[9]。

1.2 β-呋喃果糖苷酶概述

1.2.1 β-呋喃果糖苷酶简介

β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase，EC 3.2.1.26）又称转化酶或蔗糖酶，该酶同时具有水解活性和转糖基活性，它能以蔗糖为底物将其水解生成葡萄糖和果糖，再将生成的果糖通过转糖基作用转移至蔗糖末端果糖基上，从而形成低聚果糖^[10]。目前可以用微生物来源的β-呋喃果糖苷酶催化蔗糖合成低聚果糖。

1.2.2 β-呋喃果糖苷酶合成不同构型FOS进展

1. ¹F-FOS

来源于微生物的β-呋喃果糖苷酶可用于合成 β-2,1 糖苷键连接的 ¹F-FOS 。不同微生物来源的果糖苷酶合成¹F-FOS产量如表1-1所示。

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