论文总字数：31676字

摘 要

结肠癌是常见的且死亡率高的恶性肿瘤，目前药物治疗仍面临诸多问题。竹节香附素A（RA）是从银莲花中提取的一种三萜化合物，具备抗肿瘤的活性，然而其抗人结肠癌细胞的作用和机制仍然不清楚。因此，在本课题研究中，MTT结果表明RA可以有效的降低结肠癌细胞的存活率，并表现出时间依赖性和浓度依赖性；同时，Annexin/FITC PI双染实验、JC-1染色以及Western Blot实验揭示RA通过线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡。随后，细胞集落形成以及细胞周期实验显示RA能够抑制肿瘤增殖。在机制研究中， Western blot实验、RT-PCR、免疫荧光实验发现RA通过Wnt/β-catenin和NF-κB信号通路促进结肠癌细胞凋亡并且通过siRNA干扰实验验证。在体内实验中，建立SW480移植瘤裸鼠模型并通过免疫组化以及TUNEL实验发现RA能够显著的抑制裸鼠体内移植瘤的生长并且其抗结肠癌的机制与体外一致。综上，RA调控Wnt/β-catenin和NF-κB信号通路诱导人结肠癌细胞凋亡，提示RA作为一种新型的结肠癌治疗药物具有广阔的开发前景。

关键词：竹节香附素A 结肠癌 凋亡 Wnt/β-catenin通路 NF-κB信号通路

Raddenin A induces human colorectal cancer apoptosis via Wnt/β-catenin and NF-κB signal pathway

Abstract

Colorectal cancer (CRC) remains common lethal human malignancies with high incidence and lack of effective therapy. Raddeanin A (RA), an active triterpenoid saponins extracted from the root of Anemone raddeana, has once reported to have anti-tumor activity. However, the therapeutic effects and mechnisms of RA in CRC remain elusive. In this study, we investigated the efficacy of RA and further molecular mechanisms on Colorectal cancer. First, We found that RA inhibited the cell viability of SW480, LOVO, Caco-2 and HT-29 cells by using MTT analysis. Then, apoptosis induced by RA was studied using Annexin V-FITC/PI binding and JC-1 staining by flow cytometry analysis. Next, cell colony formation assay and cell cycle test revealed that RA can inhibit cell proliferation through arresting cells G0/G1 phases. In mechanism, we found RA restrained cells proliferation and induced apoptosis in vitro and in vivo via suppressing Wnt/β-catenin and NF-κB signaling pathway by Western bloting, Immunofluorescence and Immunohistochemistry experiments. Taken together, our study demonstrated that RA had good anti-tumor effects and could effectively inhibit Colorectal cancer proliferation. Therefore, these findings suggested that RA may hold a promise as a novel therapeutic agent for CRC therapy.

Key words: Raddeanin A, Colorectal cancer, Apoptosis, Wnt/β-catenin pathway, NF-κB pathway

目录

摘 要 I

Abstract II

目录 III

第一章 前言 5

1.1 结肠癌的发病机制 5

1.2 竹节香附素A研究进展 6

1.3 研究目的和意义 6

第二章 竹节香附素A体外抗结肠癌的药效以及对线粒体凋亡通路的影响 7

2.1 实验试剂与仪器 7

2.1.1 实验试剂 7

2.1.2 实验仪器 7

2.2 实验方法 8

2.2.1 细胞培养 8

2.2.2 MTT实验 8

2.2.3 克隆形成实验 8

2.2.4 细胞周期实验 8

2.2.5 Hoechst33258染色实验 8

2.2.6 Annexin V /FITC PI双染实验 8

2.2.7 JC-1染色 8

2.2.8 总蛋白提取 9

2.2.9 Western blotting 蛋白印迹实验 9

2.2.10 细胞总RNA提取 9

2.2.11 统计学处理 9

2.3 实验结果 10

2.3.1 RA诱导结肠癌细胞的凋亡 10

2.3.2 RA抑制SW480、LOVO细胞的增殖 12

2.3.3 RA对线粒体凋亡信号通路影响 13

2.4 讨论 15

2.5 小结 16

第三章 竹节香附素A抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥抗人结肠癌的作用 17

3.1 实验试剂与仪器 17

3.1.1 实验试剂 17

3.1.2 实验仪器 17

3.2 实验方法 17

3.2.1 MTT实验 17

3.2.2 胞浆蛋白以及核蛋白提取 17

3.2.3 Western Blotting 实验 17

3.2.4 免疫荧光实验 18

3.2.5 细胞转染 18

3.2.6 统计学处理 18

3.3 实验结果 19

3.3.1 RA抑制β-catenin蛋白的核转位 19

3.3.2 RA通过抑制AKT/GSK3β以及LRP6磷酸化减少β-catenin蛋白的核转位 19

3.3.3 RA调控Wnt/β-catenin信号通路诱导细胞凋亡 19

3.4 讨论 22

3.5 小结 23

第四章 竹节香附素A调控NF-κB信号通路发挥抗人结肠癌作用 24

4.1 实验材料与方法 24

4.2 实验结果 24

4.2.1 RA对NF-κB信号通路的影响 24

4.2.2 RA通过NF-κB信号通路诱导细胞凋亡 24

4.3 讨论 27

4.4 小结 27

第五章 竹节香附素A体内抗结肠癌的药效及机制研究 28

5.1 实验试剂与仪器 28

5.1.1 实验试剂 28

5.1.2 实验仪器 28

5.2 实验方法 28

5.2.1 细胞培养 28

5.2.2 移植瘤裸鼠模型建立 28

5.2.3 免疫组化实验 28

5.2.4 组织总RNA提取以及RT-PCR实验 28

5.2.5 统计学分析 29

5.3 实验结果 29

5.3.1 RA在体内抑制裸鼠异种移植结肠癌生长 29

5.3.2 RA在体内诱导结肠癌细胞凋亡 29

5.3.3 RA在体内抗结肠癌药效研究 29

5.4 讨论 32

5.5 小结 33

第六章 课题创新与展望 34

6.1 课题创新点 34

6.2 展望 34

参考文献 36

本科期间获得成果 39

致谢 40

第一章 前言

1.1 结肠癌的发病机制

结肠癌是常见的且死亡率高的恶性肿瘤，其死亡率居于第3位，仅次于肺癌和肝癌^[1]。中国癌症中心数据显示，结肠癌的发病与生活习惯等多种因素有关。这些因素会进一步导致结肠细胞癌基因、肿瘤抑制基因和DNA修复机制相关基因的突变^[2]。基因组的不稳定也是一种发病机制，包括染色体不稳定性、微卫星不稳定性和CpG岛甲基化表型三种途径^[3]。以上的基因突变会使细胞内的重要信号通路发生异常，包括β-catenin、MAPK/PI3K、TGF-β、TP5等。除了基因突变以外，表观遗传修饰以及非编码RNA的改变均会调控这些信号通路引发结肠癌。

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